日本血吸蟲bmi1基因的克隆表達(dá)、不同發(fā)育階段差異表達(dá)分析及影響細(xì)胞增殖的體外研究.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。據(jù)WHO的最新報道，人體血吸蟲病流行于亞州、非洲及拉丁美洲的74個國家和地區(qū)，估計有7億人口受到血吸蟲病的威脅，約2.07億人口被感染，其中85％的感染者存在于亞洲，每年全球約有百萬人死于此病。我國是日本血吸蟲病流行區(qū)，尚有454個疫區(qū)縣(市、區(qū))，約6千萬人受到血吸蟲病威脅，感染人數(shù)近41萬。經(jīng)過半個世紀(jì)的努力，至今仍未有一種安全有效的疫苗能成功應(yīng)用于血吸蟲病的預(yù)防。目前治療

2、與控制血吸蟲病主要依賴于化學(xué)藥物-吡喹酮，然而由于反復(fù)用藥引起耐藥性的機(jī)會將可能增加。因此，開發(fā)新的防治策略對血吸蟲病的長期控制具有重要意義。血吸蟲在其流行傳播過程中，需要經(jīng)歷復(fù)雜的生命周期。若以干擾血吸蟲的生命周期為靶點，通過對調(diào)控生長發(fā)育關(guān)鍵基因的尋找及其功能的研究可能達(dá)到阻斷血吸蟲生長發(fā)育的目的，為血吸蟲病的預(yù)防提供新思路。
　　 調(diào)節(jié)血吸蟲生長發(fā)育的分子機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究主要集中在TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子beta)及

3、PTK(蛋白酪氨酸激酶)信號通路的研究。由于扁形蠕蟲的穩(wěn)定細(xì)胞系至今尚未建立，哺乳動物細(xì)胞系常被用來評價一些血吸蟲信號通路蛋白的功能。作為多梳蛋白家族(Polycomb group)成員之一，bmi1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1，B細(xì)胞特異性小鼠白血病病毒整合位點1)基因已在模式生物及哺乳動物中顯示具有調(diào)節(jié)生長發(fā)育、細(xì)胞增殖及維持干細(xì)胞自

4、我更新的重要功能，然而對于日本血吸蟲bmi1基因的功能所知甚少。本研究以BMI1的環(huán)指保守功能域序列對日本血吸蟲的核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對搜索，最終找到日本血吸蟲的bmi1基因序列，命名為Sjbmi1。通過分子克隆表達(dá)技術(shù)獲得純化的SjBMI1蛋白及抗血清，血清學(xué)實驗顯示重組SjBMI1(rSjBMI1)蛋白可以被日本血吸蟲感染血清識別，而且Anti-rSjBMI1抗血清可以識別成蟲及蟲卵粗抗原中的對應(yīng)蛋白條帶；定量PCR(qPCR)及免

5、疫印跡(western blot,WB)實驗證實Sjbmi1基因高表達(dá)于雙性感染的成蟲及蟲卵階段，免疫熒光(immunofluorescence，IF)實驗顯示在雙性感染的雄性成蟲的睪丸及雌性成蟲的卵巢高表達(dá)SjBMI1，而單性感染的雄蟲睪丸及雌蟲卵巢未顯示SjBMI1的表達(dá)；Sjbmi1基因可以在人鼻咽癌細(xì)胞(CNE2)中進(jìn)行異源性表達(dá)，并且MTT、細(xì)胞周期檢測、損傷修復(fù)實驗及細(xì)胞核Hoechst染色實驗顯示Sj bmi1的表達(dá)會抑制

6、CNE2細(xì)胞增殖活性及遷移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；WB及逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗顯示SjBMI1可抑制內(nèi)源性人BMI1(hBMI1)蛋白表達(dá)，但對hBMI1 mRNA的表達(dá)沒有影響，揭示其抑制作用主要在轉(zhuǎn)錄后的蛋白表達(dá)階段。
　　 本論文對SjBMI1基因的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式及功能研究進(jìn)行了較為系統(tǒng)的闡述，對深入理解日本血吸蟲的生長發(fā)育、生命周期轉(zhuǎn)換及生殖器官成熟機(jī)制具有重要意義，并從干預(yù)血吸蟲的生長發(fā)育角度為血吸蟲病的防治提供了重要線索

7、。
　　 1、研究目的：
　　 基于哺乳動物及模式生物研究中bmi1基因在生長發(fā)育、細(xì)胞增殖及干細(xì)胞自我更新方面的重要功能，尋找與認(rèn)識日本血吸蟲bmi1同源基因?qū)ρx防治工作及深入理解日本血吸蟲的生長發(fā)育機(jī)制具有重要意義，本研究目的包括：
　　 (1)尋找識別、克隆表達(dá)及鑒定Sjbmi1基因；(2)研究SjBMI1在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式及其組織學(xué)定位，探討其在日本血吸蟲生長發(fā)育及生殖器官形成中的作用；(3)

8、異源性表達(dá)Sjbmi1基因，在細(xì)胞水平探討其調(diào)控細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。
　　 2、研究方法：
　　 2.1日本血吸蟲bmi1(Sjbmi1)的基因識別及基因結(jié)構(gòu)
　　 從公共數(shù)據(jù)庫下載人、大鼠、小鼠、果蠅的bmi1基因序列，進(jìn)行序列比對，找出環(huán)指保守功能域，以此序列在日本血吸蟲核酸序列庫中進(jìn)行tblastn比對，找到一條與hBMI1相似度最高的EST序列(GenBank Accession NO.AY815872.

9、1)，進(jìn)一步分析其ORF序列，發(fā)現(xiàn)在第93位可能存在點缺失，最終通過測序證實在此位點缺失一個T堿基(完整序列：gb/Eu912526.1)。將Sjbmi1全長序列與日本血吸蟲DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，找出包含此基因的contigs，從而分析Sjbmi1基因的外顯子與內(nèi)含子分布。
　　 2.2Sjbmi1的生物信息學(xué)分析
　　 利用ExPASY的生物信息學(xué)工具進(jìn)行SjBMI1理化特征的預(yù)測、結(jié)構(gòu)域的分析、三維空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及針

10、對關(guān)鍵功能域進(jìn)化樹的繪制。
　　 2.3Sjbmi1的基因擴(kuò)增、克隆和重組蛋白的表達(dá)純化
　　 2.3.1Sjbmi1的基因擴(kuò)增、克?。焊鶕?jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a多克隆位點設(shè)計引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從日本血吸蟲成蟲cDNA中擴(kuò)增出Sjbmi1的CDS。定向克隆該序列到質(zhì)粒pET-28a中，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定。
　　 2.3.2 rSjBMI1蛋白的表達(dá)和純化：將

11、構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-SjBMI1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE)，誘導(dǎo)表達(dá)后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰電泳(SDS-PAGE)鑒定rSjBMI1蛋白的表達(dá)，親和層析獲得純化的rSjBMI1蛋白。
　　 2.4 rSjBMI1的免疫血清學(xué)鑒定
　　 rSjBMI1免疫大鼠后獲得抗血清。用WB法鑒定rSjBMI1，包括用rSjBMI1抗血清識別日本血吸蟲蟲卵與成蟲的粗抗原、感染S.japonicum的兔血清識別rS

12、jBMI1蛋白及抗HIS-tag單克隆抗體識別rSjBMI1蛋白。
　　 2.5Sjbmi1在日本血吸蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)
　　 TRIzol法分別提取日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、雙性感染的雄性成蟲及雌性成蟲的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，采用設(shè)計的特異性引物，利用定量PCR(qPCR)對cDNA中的Sjbmi1基因進(jìn)行擴(kuò)增，了解不同階段其mRNA表達(dá)水平。各取20μg不同階段蟲體粗抗原用于WB分析，了解不同階段SjBMI1

13、蛋白表達(dá)水平。
　　 2.6 SjBMI1在日本血吸蟲的組織定位
　　 制備蟲卵及成蟲的組織切片，采用免疫熒光法，用抗rSjBMI1大鼠血清對蟲卵、雙性感染的雄性成蟲、雌性成蟲及單性感染的雄性成蟲、雌性成蟲中的SjBMI1進(jìn)行免疫定位。
　　 2.7Sjbmi1基因的表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　 構(gòu)建pIRES2-EGFP-SjBMI1重組質(zhì)粒，質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染后在人鼻咽癌細(xì)胞(CNE2)中進(jìn)行異源性表

14、達(dá)。采用MTT及細(xì)胞周期法評價細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞核染色法評價細(xì)胞凋亡水平，損傷修復(fù)試驗評價細(xì)胞的遷移與增殖能力。
　　 2.8Sjbmil基因?qū)?nèi)源性hbmi1基因表達(dá)的影響
　　 在人鼻咽癌細(xì)胞中進(jìn)行Sjbmi1基因的瞬時表達(dá)后，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR法檢測hbmi1基因的mRNA水平；提取總蛋白，WB法檢測hBMI1基因的蛋白水平。
　　 3、研究結(jié)論：
　　 3.1生物信息學(xué)分析、測

15、序及免疫血清學(xué)實驗證實gb/EU912526.1序列為日本血吸蟲SjBMI1的編碼基因，其ORF編碼354個氨基酸，具有環(huán)指保守功能域，在物種進(jìn)化過程具有保守性
　　 3.2構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SjBMI1，并成功表達(dá)分子量約為43.5kD的重組蛋白rSjBMI1
　　 3.3Sjbmi1基因表達(dá)于日本血吸蟲蟲卵、雙性感染的成蟲階段，且分布在成蟲睪丸與卵巢，而單性感染的雌、雄成蟲表達(dá)水平明顯降低，揭示該基