日本血吸蟲bmi1基因的克隆表達、不同發(fā)育階段差異表達分析及影響細胞增殖的體外研究.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。據WHO的最新報道，人體血吸蟲病流行于亞州、非洲及拉丁美洲的74個國家和地區(qū)，估計有7億人口受到血吸蟲病的威脅，約2.07億人口被感染，其中85％的感染者存在于亞洲，每年全球約有百萬人死于此病。我國是日本血吸蟲病流行區(qū)，尚有454個疫區(qū)縣(市、區(qū))，約6千萬人受到血吸蟲病威脅，感染人數近41萬。經過半個世紀的努力，至今仍未有一種安全有效的疫苗能成功應用于血吸蟲病的預防。目前治療

2、與控制血吸蟲病主要依賴于化學藥物-吡喹酮，然而由于反復用藥引起耐藥性的機會將可能增加。因此，開發(fā)新的防治策略對血吸蟲病的長期控制具有重要意義。血吸蟲在其流行傳播過程中，需要經歷復雜的生命周期。若以干擾血吸蟲的生命周期為靶點，通過對調控生長發(fā)育關鍵基因的尋找及其功能的研究可能達到阻斷血吸蟲生長發(fā)育的目的，為血吸蟲病的預防提供新思路。
　　 調節(jié)血吸蟲生長發(fā)育的分子機制十分復雜，目前研究主要集中在TGF-β(轉化生長因子beta)及

3、PTK(蛋白酪氨酸激酶)信號通路的研究。由于扁形蠕蟲的穩(wěn)定細胞系至今尚未建立，哺乳動物細胞系常被用來評價一些血吸蟲信號通路蛋白的功能。作為多梳蛋白家族(Polycomb group)成員之一，bmi1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1，B細胞特異性小鼠白血病病毒整合位點1)基因已在模式生物及哺乳動物中顯示具有調節(jié)生長發(fā)育、細胞增殖及維持干細胞自

4、我更新的重要功能，然而對于日本血吸蟲bmi1基因的功能所知甚少。本研究以BMI1的環(huán)指保守功能域序列對日本血吸蟲的核酸序列數據庫進行比對搜索，最終找到日本血吸蟲的bmi1基因序列，命名為Sjbmi1。通過分子克隆表達技術獲得純化的SjBMI1蛋白及抗血清，血清學實驗顯示重組SjBMI1(rSjBMI1)蛋白可以被日本血吸蟲感染血清識別，而且Anti-rSjBMI1抗血清可以識別成蟲及蟲卵粗抗原中的對應蛋白條帶；定量PCR(qPCR)及免

5、疫印跡(western blot,WB)實驗證實Sjbmi1基因高表達于雙性感染的成蟲及蟲卵階段，免疫熒光(immunofluorescence，IF)實驗顯示在雙性感染的雄性成蟲的睪丸及雌性成蟲的卵巢高表達SjBMI1，而單性感染的雄蟲睪丸及雌蟲卵巢未顯示SjBMI1的表達；Sjbmi1基因可以在人鼻咽癌細胞(CNE2)中進行異源性表達，并且MTT、細胞周期檢測、損傷修復實驗及細胞核Hoechst染色實驗顯示Sj bmi1的表達會抑制

6、CNE2細胞增殖活性及遷移能力，并促進細胞凋亡；WB及逆轉錄PCR實驗顯示SjBMI1可抑制內源性人BMI1(hBMI1)蛋白表達，但對hBMI1 mRNA的表達沒有影響，揭示其抑制作用主要在轉錄后的蛋白表達階段。
　　 本論文對SjBMI1基因的結構特征、表達模式及功能研究進行了較為系統(tǒng)的闡述，對深入理解日本血吸蟲的生長發(fā)育、生命周期轉換及生殖器官成熟機制具有重要意義，并從干預血吸蟲的生長發(fā)育角度為血吸蟲病的防治提供了重要線索

7、。
　　 1、研究目的：
　　 基于哺乳動物及模式生物研究中bmi1基因在生長發(fā)育、細胞增殖及干細胞自我更新方面的重要功能，尋找與認識日本血吸蟲bmi1同源基因將對血吸蟲防治工作及深入理解日本血吸蟲的生長發(fā)育機制具有重要意義，本研究目的包括：
　　 (1)尋找識別、克隆表達及鑒定Sjbmi1基因；(2)研究SjBMI1在不同發(fā)育階段的表達模式及其組織學定位，探討其在日本血吸蟲生長發(fā)育及生殖器官形成中的作用；(3)

8、異源性表達Sjbmi1基因，在細胞水平探討其調控細胞增殖的可能機制。
　　 2、研究方法：
　　 2.1日本血吸蟲bmi1(Sjbmi1)的基因識別及基因結構
　　 從公共數據庫下載人、大鼠、小鼠、果蠅的bmi1基因序列，進行序列比對，找出環(huán)指保守功能域，以此序列在日本血吸蟲核酸序列庫中進行tblastn比對，找到一條與hBMI1相似度最高的EST序列(GenBank Accession NO.AY815872.

9、1)，進一步分析其ORF序列，發(fā)現在第93位可能存在點缺失，最終通過測序證實在此位點缺失一個T堿基(完整序列：gb/Eu912526.1)。將Sjbmi1全長序列與日本血吸蟲DNA數據庫進行對比，找出包含此基因的contigs，從而分析Sjbmi1基因的外顯子與內含子分布。
　　 2.2Sjbmi1的生物信息學分析
　　 利用ExPASY的生物信息學工具進行SjBMI1理化特征的預測、結構域的分析、三維空間結構的構建及針

10、對關鍵功能域進化樹的繪制。
　　 2.3Sjbmi1的基因擴增、克隆和重組蛋白的表達純化
　　 2.3.1Sjbmi1的基因擴增、克?。焊鶕康幕虻腛RF和原核表達質粒pET-28a多克隆位點設計引物，利用聚合酶鏈反應(PCR)從日本血吸蟲成蟲cDNA中擴增出Sjbmi1的CDS。定向克隆該序列到質粒pET-28a中，對重組質粒進行PCR、雙酶切和測序鑒定。
　　 2.3.2 rSjBMI1蛋白的表達和純化：將

11、構建好的重組質粒pET28a-SjBMI1轉化至大腸桿菌BL21(DE)，誘導表達后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰電泳(SDS-PAGE)鑒定rSjBMI1蛋白的表達，親和層析獲得純化的rSjBMI1蛋白。
　　 2.4 rSjBMI1的免疫血清學鑒定
　　 rSjBMI1免疫大鼠后獲得抗血清。用WB法鑒定rSjBMI1，包括用rSjBMI1抗血清識別日本血吸蟲蟲卵與成蟲的粗抗原、感染S.japonicum的兔血清識別rS

12、jBMI1蛋白及抗HIS-tag單克隆抗體識別rSjBMI1蛋白。
　　 2.5Sjbmi1在日本血吸蟲不同發(fā)育階段的表達
　　 TRIzol法分別提取日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、雙性感染的雄性成蟲及雌性成蟲的總RNA，逆轉錄后獲得cDNA，采用設計的特異性引物，利用定量PCR(qPCR)對cDNA中的Sjbmi1基因進行擴增，了解不同階段其mRNA表達水平。各取20μg不同階段蟲體粗抗原用于WB分析，了解不同階段SjBMI1

13、蛋白表達水平。
　　 2.6 SjBMI1在日本血吸蟲的組織定位
　　 制備蟲卵及成蟲的組織切片，采用免疫熒光法，用抗rSjBMI1大鼠血清對蟲卵、雙性感染的雄性成蟲、雌性成蟲及單性感染的雄性成蟲、雌性成蟲中的SjBMI1進行免疫定位。
　　 2.7Sjbmi1基因的表達對鼻咽癌細胞增殖能力的影響
　　 構建pIRES2-EGFP-SjBMI1重組質粒，質脂體轉染后在人鼻咽癌細胞(CNE2)中進行異源性表

14、達。采用MTT及細胞周期法評價細胞增殖活性，細胞核染色法評價細胞凋亡水平，損傷修復試驗評價細胞的遷移與增殖能力。
　　 2.8Sjbmil基因對內源性hbmi1基因表達的影響
　　 在人鼻咽癌細胞中進行Sjbmi1基因的瞬時表達后，提取mRNA并逆轉錄成cDNA，PCR法檢測hbmi1基因的mRNA水平；提取總蛋白，WB法檢測hBMI1基因的蛋白水平。
　　 3、研究結論：
　　 3.1生物信息學分析、測

15、序及免疫血清學實驗證實gb/EU912526.1序列為日本血吸蟲SjBMI1的編碼基因，其ORF編碼354個氨基酸，具有環(huán)指保守功能域，在物種進化過程具有保守性
　　 3.2構建了重組原核表達質粒pET28a-SjBMI1，并成功表達分子量約為43.5kD的重組蛋白rSjBMI1
　　 3.3Sjbmi1基因表達于日本血吸蟲蟲卵、雙性感染的成蟲階段，且分布在成蟲睪丸與卵巢，而單性感染的雌、雄成蟲表達水平明顯降低，揭示該基