珙桐CesA基因的克隆及在種子發(fā)育中的表達(dá)分析.pdf

1、珙桐又名鴿子樹，是我國(guó)特有的一級(jí)保護(hù)珍稀瀕危植物，第三紀(jì)古熱帶植物孑遺種，具有很高的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值和觀賞價(jià)值。其種子繁殖能力弱，自然更新困難，休眠期長(zhǎng)，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻。種子敗育嚴(yán)重是制約珙桐有性繁殖的重要原因之一，這種現(xiàn)象在許多木本植物中是普遍存在的。目前對(duì)于這種自發(fā)的種子敗育機(jī)制缺乏分子水平上的解釋。本實(shí)驗(yàn)前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，已建立珙桐果實(shí)和種子的unigene庫(kù)，以上述unigene庫(kù)作為參考序列，通過數(shù)字表達(dá)譜分析，在珙桐正常種

2、子和敗育種子中篩選出2361個(gè)差異表達(dá)基因。其中我們發(fā)現(xiàn)纖維素合酶基因（CesA）在敗育種子中較正常種子呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過分析纖維素合酶基因在珙桐種子發(fā)育過程中的表達(dá)模式，結(jié)合纖維素含量的測(cè)定，初步研究了珙桐中纖維素合酶的活性變化規(guī)律及在種子發(fā)育過程中所行駛的功能。并進(jìn)一步選擇了一個(gè)基因，通過對(duì)該基因的表達(dá)分析，克隆，蛋白表達(dá)和功能驗(yàn)證進(jìn)一步明確該基因的功能。本研究旨在挖掘珙桐基因資源，解析種子敗育的分子機(jī)制，為理解種子

3、自發(fā)敗育的生物學(xué)意義提供理論基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.珙桐纖維素合酶基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
　　在珙桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出14個(gè)纖維素合酶基因（CesA），共有22個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在敗育種子中呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達(dá)。其中有7個(gè)基因在正常種子和敗育種子中表達(dá)差異顯著。
　　2.纖維素合酶基因的表達(dá)分析
　　qPCR檢測(cè)表明CesA基因在敗育種子中呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達(dá)，挑選4個(gè)在敗育種子中顯著上調(diào)的CesA基因

4、進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明它們表達(dá)模式相似，在敗育種子中表達(dá)量均顯著高于正常種子，且在正常種子發(fā)育后期上調(diào)表達(dá)。將表達(dá)差異最顯著的c43681.graph_c0基因在珙桐不同組織中進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示c43681.graph_c0基因在花和果實(shí)等生殖器官中表達(dá)量較高，在葉和芽等營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)量較低，在敗育的種子中表達(dá)量最高。證明c43681.graph_c0基因在生殖器官中偏好表達(dá)。
　　3.c43681.graph_c0基因的克隆

5、及編碼產(chǎn)物特征分析
　　設(shè)計(jì)引物將序列c43681.graph_c0基因進(jìn)行克隆獲得882 bp片段，經(jīng)序列分析，其編碼產(chǎn)物包含292個(gè)氨基酸，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，等電點(diǎn)為9.07，為堿性蛋白，與擬南芥纖維素合酶4號(hào)催化亞基同源性最高，含有在植物中特有的保守區(qū)域。
　　4.目標(biāo)基因表達(dá)蛋白質(zhì)
　　將成功構(gòu)建的pET28/CesA重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表達(dá)，使用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。通過對(duì)誘導(dǎo)