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文檔簡介
1、背景與目的:神經(jīng)干細胞(neuralstemcells,NSCs)的發(fā)現(xiàn),改變了神經(jīng)細胞不能再生的傳統(tǒng)觀念,開辟了神經(jīng)修復(fù)的新紀(jì)元。然而,用于人的神經(jīng)干細胞主要來源于流產(chǎn)胚胎,其有限的來源及倫理學(xué)的爭議使其應(yīng)用受到極大的限制。因此,尋找新的干細胞來源,用于修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷,勢在必行。 間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是來源于中胚層的多能干細胞,具有高度自我更新能力和多向分化潛能,在適宜的體內(nèi)或體
2、外環(huán)境下,MSCs不僅可分化為造血細胞,還具有分化為造血以外的多種組織特別是中胚層組織細胞的能力,甚至還具有跨胚層分化為神經(jīng)外胚層起源組織細胞的潛能,因而具有高度的可塑性。且其倫理問題大為減少,是細胞移植和組織工程的新型種子細胞,具有廣闊的應(yīng)用前景。骨髓MSCs是主要的MSCs來源,但其必須通過又創(chuàng)性的途徑獲得,而且其隨著年齡的增長,干細胞數(shù)量顯著減少。其它組織中也存在有MSCs,包括動員的外周血、臍血、乳牙和臍帶等,然而,從這些組織中
3、得到的細胞數(shù)量亦較有限。因此,尋找更易獲得、含量豐富且易于培養(yǎng)的MSCs新來源,對MSCs的實驗研究和臨床應(yīng)用,具有重大意義。 人類羊膜是胎膜的最內(nèi)層,由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成,薄而透明,在胎盤面與絨毛膜相貼,在胎兒出生后常被丟棄。本研究從人的羊膜分離、培養(yǎng)MSCs,使其在體外大量擴增,分別將其通過體外誘導(dǎo)和大鼠的腦內(nèi)移植,均表達神經(jīng)細胞的表型。本研究發(fā)現(xiàn),羊膜來源的MSCs(以下簡稱羊膜MSCs)易于在體外培養(yǎng)、擴增,具有良好的
4、可塑性,作為神經(jīng)細胞移植和神經(jīng)組織工程種子細胞的細胞來源,具有廣闊的應(yīng)用潛力。 方法:無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜,PBS充分沖洗后剪成碎片,用0.25%的胰蛋白酶室溫消化30min,共3次,然后用含1.0g/L的膠原酶Ⅳ和0.1g/LDNA酶I的DMEM/F12培養(yǎng)液37~C消化1h,制成單細胞懸液,用含10%胎牛血清(fetalbovineserum,F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 分別添加2種濃
5、度的堿性成纖維生長因子(bFGF)進行細胞培養(yǎng),隨機分為3組:A組不加bFGF作為對照;B組加入20μg/LbFGF;C組加入1∞μg/LbFGF。倒置相差顯微鏡觀察各組細胞生長狀況。于培養(yǎng)的第8d和第13d分別用MTT法測定細胞活力,以觀察bFGF對細胞增殖的影響。 取4-6代的細胞用流式細胞儀分析細胞表面標(biāo)志:CD29、CD34、CD45、CD44、HLA-ABC、HLA-DR。 取培養(yǎng)3代的羊膜MSCs,將其與纖維
6、蛋白膠5×105/mi的濃度混合后,用含10%FBS和20μg/LbFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng),分別于培養(yǎng)的第l、3、7、14天觀察細胞的生長和生存情況。 取第3代的羊膜MSCs,用20~g/LbFGF和30pmol/L全反式維甲酸(Retinicacid,RA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞向神經(jīng)細胞分化。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,甲苯胺蘭染色觀察誘導(dǎo)細胞內(nèi)的尼氏體,于誘導(dǎo)前進行神經(jīng)巢蛋白(nestin)、誘導(dǎo)后4d和7d分
7、別進行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學(xué)染色。 用自由落體硬膜外撞擊法制作中型外傷性腦創(chuàng)傷(traumaticbraininjury,TBI)模型。Wistar大鼠80只,每組20只,隨機分為4組:A組,假損傷組(Sham),只開顱鉆孔不進行硬膜外撞擊,不移植細胞,做為陰性對照組:B組,假移植組(TBI+NS),開顱鉆孔進行硬膜外撞擊,1d后,在損傷區(qū)注射生理鹽水10μl,做為干預(yù)對照;C組
8、,移植組(TBI+羊膜MSCs),開顱鉆孔進行硬膜外撞擊,1d后,在損傷區(qū)注射含人羊膜MSCs的生理鹽水10μl;D組,纖維蛋白膠(fibringlue,F(xiàn)G)和細胞移植組(TBI+FG+羊膜MSCs),開顱鉆孔進行硬膜外撞擊,1d后,將羊膜MSCs分別與主體膠和催化劑混合,在損傷區(qū)用纖維蛋白膠專用注射器單點注射混合液l∞μl。每只大鼠移植細胞l×106個。分別于2w和4w處死動物。用免疫組化方法檢測神經(jīng)細胞特異性標(biāo)記物,用HE染色觀察
9、神經(jīng)組織變化情況。 結(jié)果:經(jīng)酶消化從羊膜分離的細胞于24h內(nèi)貼壁,72h細胞呈圓形、梭形、星形和多角形等多種形態(tài),培養(yǎng)至14~16d,細胞達80%~90%融合,呈放射狀或漩渦狀分布;傳代后細胞7~10d鋪滿瓶底,傳至3代,細胞形態(tài)很均勻,長梭形,有偽足;培養(yǎng)6代后,部分細胞仍呈長梭形,增生活躍,部分細胞呈扁平狀,不再增殖。體外培養(yǎng)8~10代以后,細胞的增殖速度明顯減慢,細胞出現(xiàn)老化,大多數(shù)細胞呈寬大、扁平的多角形,不再增殖。
10、 通過MTT檢測和倒置相差顯微鏡觀察顯示:終濃度為20μg/LbFGF組羊膜MSCs的體外增殖能力較其他兩組為強(P<0.05),成纖維細胞樣細胞優(yōu)勢生長,上皮細胞樣細胞的生長被抑制。而無bFGF組和1∞μg/LbFGF組則主要為上皮細胞樣細胞增殖。 流式細胞檢測:羊膜MSCs表達CD29、CD44、HLA-ABC,不表達CD34、CD45、HLA-DR。 在體外培養(yǎng)條件下,與纖維蛋白膠混合的羊膜MSCs能夠在含lO
11、%FBS和20μg/LbFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)存活,呈梭形、星形和多角形等形態(tài)。 培養(yǎng)3代的羊膜MSCs表達nestin達82.0士3.3%;經(jīng)RA和bFGF誘導(dǎo)后發(fā)生形態(tài)改變,呈雙極或多極的神經(jīng)元樣形態(tài),其細胞質(zhì)內(nèi)存在可被甲苯胺蘭染色的團塊狀或顆粒狀的嗜堿性物質(zhì),即尼氏體;誘導(dǎo)4d時NSE表達率為40.4~2.0%,而誘導(dǎo)7d時達到78.1士3.4%,二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不表達GFAP。 將
12、羊膜MSCs移植到損傷大鼠的腦組織內(nèi),2w時可觀察到損傷區(qū)的神經(jīng)元變性壞死較損傷組減少(P<0.05),并且羊膜MSCs能夠在損傷腦組織內(nèi)分化為神經(jīng)細胞,表達NSE和GFAP。而且,將羊膜MSCs和纖維蛋白膠混合移植于腦損傷大鼠的腦內(nèi),其能夠在纖維蛋白膠內(nèi)存活并在局部微環(huán)境的作用下分化為神經(jīng)細胞,表達NSE和GFAP。 結(jié)論:1.用胰蛋白酶、膠原酶Ⅳ和DNA酶I能夠從羊膜分離MSCs,羊膜MSCs可在含10%FBS和20.g/L
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