人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、分化及移植治療腦外傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)，改變了神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)觀念，開(kāi)辟了神經(jīng)修復(fù)的新紀(jì)元。然而，用于人的神經(jīng)干細(xì)胞主要來(lái)源于流產(chǎn)胚胎，其有限的來(lái)源及倫理學(xué)的爭(zhēng)議使其應(yīng)用受到極大的限制。因此，尋找新的干細(xì)胞來(lái)源，用于修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷，勢(shì)在必行。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是來(lái)源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體

2、外環(huán)境下，MSCs不僅可分化為造血細(xì)胞，還具有分化為造血以外的多種組織特別是中胚層組織細(xì)胞的能力，甚至還具有跨胚層分化為神經(jīng)外胚層起源組織細(xì)胞的潛能，因而具有高度的可塑性。且其倫理問(wèn)題大為減少，是細(xì)胞移植和組織工程的新型種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。骨髓MSCs是主要的MSCs來(lái)源，但其必須通過(guò)又創(chuàng)性的途徑獲得，而且其隨著年齡的增長(zhǎng)，干細(xì)胞數(shù)量顯著減少。其它組織中也存在有MSCs，包括動(dòng)員的外周血、臍血、乳牙和臍帶等，然而，從這些組織中

3、得到的細(xì)胞數(shù)量亦較有限。因此，尋找更易獲得、含量豐富且易于培養(yǎng)的MSCs新來(lái)源，對(duì)MSCs的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用，具有重大意義。 人類(lèi)羊膜是胎膜的最內(nèi)層，由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成，薄而透明，在胎盤(pán)面與絨毛膜相貼，在胎兒出生后常被丟棄。本研究從人的羊膜分離、培養(yǎng)MSCs，使其在體外大量擴(kuò)增，分別將其通過(guò)體外誘導(dǎo)和大鼠的腦內(nèi)移植，均表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的表型。本研究發(fā)現(xiàn)，羊膜來(lái)源的MSCs(以下簡(jiǎn)稱(chēng)羊膜MSCs)易于在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，具有良好的

4、可塑性，作為神經(jīng)細(xì)胞移植和神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)源，具有廣闊的應(yīng)用潛力。 方法：無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜，PBS充分沖洗后剪成碎片，用0．25％的胰蛋白酶室溫消化30min，共3次，然后用含1．0g/L的膠原酶Ⅳ和0．1g／LDNA酶I的DMEM／F12培養(yǎng)液37~C消化1h，制成單細(xì)胞懸液，用含10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM／F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 分別添加2種濃

5、度的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，隨機(jī)分為3組：A組不加bFGF作為對(duì)照；B組加入20μg/LbFGF；C組加入1∞μg/LbFGF。倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。于培養(yǎng)的第8d和第13d分別用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，以觀察bFGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 取4-6代的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志：CD29、CD34、CD45、CD44、HLA-ABC、HLA-DR。 取培養(yǎng)3代的羊膜MSCs，將其與纖維

6、蛋白膠5×105／mi的濃度混合后，用含10％FBS和20μg/LbFGF的DMEM／F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的第l、3、7、14天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存情況。 取第3代的羊膜MSCs，用20~g／LbFGF和30pmol／L全反式維甲酸(Retinicacid，RA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，甲苯胺蘭染色觀察誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的尼氏體，于誘導(dǎo)前進(jìn)行神經(jīng)巢蛋白(nestin)、誘導(dǎo)后4d和7d分

7、別進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 用自由落體硬膜外撞擊法制作中型外傷性腦創(chuàng)傷(traumaticbraininjury，TBI)模型。Wistar大鼠80只，每組20只，隨機(jī)分為4組：A組，假損傷組(Sham)，只開(kāi)顱鉆孔不進(jìn)行硬膜外撞擊，不移植細(xì)胞，做為陰性對(duì)照組：B組，假移植組(TBI+NS)，開(kāi)顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，在損傷區(qū)注射生理鹽水10μl，做為干預(yù)對(duì)照；C組

8、，移植組(TBI+羊膜MSCs)，開(kāi)顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，在損傷區(qū)注射含人羊膜MSCs的生理鹽水10μl；D組，纖維蛋白膠(fibringlue，F(xiàn)G)和細(xì)胞移植組(TBI+FG+羊膜MSCs)，開(kāi)顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，將羊膜MSCs分別與主體膠和催化劑混合，在損傷區(qū)用纖維蛋白膠專(zhuān)用注射器單點(diǎn)注射混合液l∞μl。每只大鼠移植細(xì)胞l×106個(gè)。分別于2w和4w處死動(dòng)物。用免疫組化方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，用HE染色觀察

9、神經(jīng)組織變化情況。 結(jié)果：經(jīng)酶消化從羊膜分離的細(xì)胞于24h內(nèi)貼壁，72h細(xì)胞呈圓形、梭形、星形和多角形等多種形態(tài)，培養(yǎng)至14～16d，細(xì)胞達(dá)80％～90％融合，呈放射狀或漩渦狀分布；傳代后細(xì)胞7～10d鋪滿(mǎn)瓶底，傳至3代，細(xì)胞形態(tài)很均勻，長(zhǎng)梭形，有偽足；培養(yǎng)6代后，部分細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭形，增生活躍，部分細(xì)胞呈扁平狀，不再增殖。體外培養(yǎng)8～10代以后，細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，細(xì)胞出現(xiàn)老化，大多數(shù)細(xì)胞呈寬大、扁平的多角形，不再增殖。

10、 通過(guò)MTT檢測(cè)和倒置相差顯微鏡觀察顯示：終濃度為20μg/LbFGF組羊膜MSCs的體外增殖能力較其他兩組為強(qiáng)(P<0．05)，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞樣細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制。而無(wú)bFGF組和1∞μg/LbFGF組則主要為上皮細(xì)胞樣細(xì)胞增殖。 流式細(xì)胞檢測(cè)：羊膜MSCs表達(dá)CD29、CD44、HLA-ABC，不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR。 在體外培養(yǎng)條件下，與纖維蛋白膠混合的羊膜MSCs能夠在含lO

11、％FBS和20μg/LbFGF的DMEM／F12培養(yǎng)基內(nèi)存活，呈梭形、星形和多角形等形態(tài)。 培養(yǎng)3代的羊膜MSCs表達(dá)nestin達(dá)82．0士3．3％；經(jīng)RA和bFGF誘導(dǎo)后發(fā)生形態(tài)改變，呈雙極或多極的神經(jīng)元樣形態(tài)，其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在可被甲苯胺蘭染色的團(tuán)塊狀或顆粒狀的嗜堿性物質(zhì)，即尼氏體；誘導(dǎo)4d時(shí)NSE表達(dá)率為40．4~2．0％，而誘導(dǎo)7d時(shí)達(dá)到78．1士3．4％，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。不表達(dá)GFAP。 將

12、羊膜MSCs移植到損傷大鼠的腦組織內(nèi)，2w時(shí)可觀察到損傷區(qū)的神經(jīng)元變性壞死較損傷組減少(P<0．05)，并且羊膜MSCs能夠在損傷腦組織內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE和GFAP。而且，將羊膜MSCs和纖維蛋白膠混合移植于腦損傷大鼠的腦內(nèi)，其能夠在纖維蛋白膠內(nèi)存活并在局部微環(huán)境的作用下分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE和GFAP。 結(jié)論：1．用胰蛋白酶、膠原酶Ⅳ和DNA酶I能夠從羊膜分離MSCs，羊膜MSCs可在含10％FBS和20．g／L