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1、鞘氨醇激酶1(SphingosineKinase1)SPK1是鞘磷脂代謝中的關(guān)鍵酶,參與了多種細(xì)胞生命活動。對SPK1的蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其N-端含有一個保守的GKGK結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在多種發(fā)生乙?;揎椀牡鞍仔蛄兄?,是一個公認(rèn)的乙酰化修飾結(jié)構(gòu)域,其中的K是發(fā)生乙?;揎椀奈稽c。據(jù)此,推斷SPK1可能發(fā)生乙?;揎棥J紫?,將Flag-SPK1轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞,用Flag-M2珠子將SPK1沉淀下來,用抗ace-Lys抗體雜
2、交,檢測到乙?;腟PK1。其次,沉淀產(chǎn)物與p300及乙酰CoA共同孵育后用抗ace-Lys抗體雜交,結(jié)果顯示p300能增強(qiáng)SPK1的乙酰化。以上結(jié)果說明SPK1是一個乙酰化修飾蛋白,可被p300乙?;?。將SPK1蛋白GKGK結(jié)構(gòu)域中的兩個K均突變?yōu)镽或Q,并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)野生型W-SPK1及突變體R-SPK1、Q-SPK1蛋白的細(xì)胞系。我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)W-SPK1的細(xì)胞檢測到SPK1蛋白的乙?;?,而
3、R-SPK1沒有檢測到乙?;沂維PK1乙酰化發(fā)生在其GK結(jié)構(gòu)域的K上。
SPK1蛋白的這種翻譯后修飾可能是其蛋白功能的一種重要的調(diào)控方式。實驗結(jié)果表明,SPK1乙?;揎椇笃浞€(wěn)定性增強(qiáng);將GKGK結(jié)構(gòu)域中的兩個K突變?yōu)镽或Q,封閉了SPK1的泛素化修飾,避免了被蛋白酶體降解。細(xì)胞形態(tài)上,穩(wěn)定表達(dá)Q-SPK1的細(xì)胞與表達(dá)W-SPK1及R-SPK1的細(xì)胞相比體積變大,但細(xì)胞生長速度變慢;流式分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定表達(dá)Q-SPK
4、1的細(xì)胞處于S期的細(xì)胞明顯增多,G2期的則減少,表明Q-SPK1阻斷細(xì)胞由S期向G2/M期的進(jìn)程。綜上,SPK1乙?;谡{(diào)控細(xì)胞生長、大小及細(xì)胞周期中有重要作用。
在體外實驗基礎(chǔ)上,以自發(fā)性2型糖尿病KK/Ay小鼠為動物模型,灌胃給予攜帶野生型及突變體spk1基因的減毒沙門氏菌,在動物整體水平評價SPK1乙酰化修飾對糖尿病動物血糖的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,口服攜帶Q-SPK1質(zhì)粒的減毒沙門氏菌可以降低2型糖尿病小鼠KK/Ay的血糖
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