高遷移率族蛋白B-1在cGVHD狼瘡腎炎小鼠腎組織的表達(dá)及雷公藤多甙的干預(yù)作用.pdf

1、目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一個累及多系統(tǒng)多器官、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病程遷延反復(fù)的自身免疫性疾病。腎臟是最容易受累的器官，狼瘡性腎炎已經(jīng)成為SLE患者致死、致殘的主要原因。在眾多導(dǎo)致狼瘡性腎炎發(fā)生和發(fā)展的因素中，細(xì)胞因子是一個關(guān)鍵因素。人高遷移率族蛋白B-1（High mobility group box1 protein，HMGB-1）是一種新型的炎性細(xì)胞因子。既往研究證實(shí)，H

2、MGB-1和多種自身免疫性疾病相關(guān)，并可能成為風(fēng)濕病治療的新靶點(diǎn)。本研究擬通過構(gòu)建慢性移植物抗宿主病（chronicgraft versus host disease，cGVHD）狼瘡樣腎炎小鼠動物模型，檢測HMGB-1和轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）在cGVHD狼瘡樣腎炎小鼠腎組織的表達(dá)情況，并觀察中藥雷公藤有效成分雷公藤多甙（tripterygium glycosides

3、，TG）及醋酸潑尼松（prednisone，Pred）、來氟米特（lefunomide，LEF）對HMGB-1及TGF-β1表達(dá)的影響，為進(jìn)一步明確HMGB-1及TGF-β1在狼瘡性腎炎中的致病作用和建立以HMGB-1為靶點(diǎn)的治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：（1）取雌性親代DBA/2的淋巴細(xì)胞分4次經(jīng)靜脈注射雌性子代F1代雜交鼠（C57BL6×DBA/2），注射時(shí)間為1d、4d、7 d、10 d，每次注射淋巴細(xì)胞數(shù)為50×1

4、06個，于第8周末制得cGVHD狼瘡樣腎炎小鼠動物模型。（2）取成模小鼠24只，隨機(jī)分成模型（LN）組、Pred組、LEF組、TG組，每組6只，在造模后第9周，分別給予生理鹽水、Pred、LEF及TG，共計(jì)28天。分別于第4w、8w、12w末代謝籠留取24小時(shí)尿液，檢測尿蛋白含量。（3）第12周末麻醉心尖取血，檢測血清BUN、SCr含量。無菌條件下摘取雙腎，切取雙腎上下極，分成數(shù)塊，置于10％中性甲醛液中固定過夜，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透

5、明，石蠟包埋。包埋好組織的蠟塊修整后在切片機(jī)上連續(xù)切片6～8張，厚度2～3μm，在30～35℃溫水中展開后置于涂有APES的載玻片上，于70℃溫箱中烘烤72小時(shí)備用。（4）腎組織病理觀察：常規(guī)石蠟切片，分別進(jìn)行HE、PAS、masson染色，觀察腎小球及小管間質(zhì)的變化。（5）應(yīng)用免疫組化方法檢測HMGB-1及。TGF-β1在動物模型腎組織的表達(dá)情況，同時(shí)分別檢測了Pred、LEF、TG藥物干預(yù)后，HMGB-1及FGF-β1在病變組織中表

6、達(dá)的變化情況。運(yùn)用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測定陽性表達(dá)物的平均光密度（MOD）。（6）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）

7、一般情況：正常對照組小鼠被毛光澤，精神狀態(tài)良好，活動自如，無異常狀態(tài)出現(xiàn)。LN組小鼠毛發(fā)干枯、飲食減少，后期部分出現(xiàn)水腫。干預(yù)組小鼠精神狀態(tài)、活動度較LN組好，無水腫。（2）各組小鼠UPE、BUN、SCr測定結(jié)果：與正常對照組相比，LN組小鼠的UPE、BUN、SCr均顯著增高（P<0.01），干預(yù)組與LN組相比，UPE、BUN、SCr下降明顯，之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。在降低UPE方面，TG組較Pred組降低更

8、明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TG組與LEF組在降低UPE、BUN、SCr方面，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（3）各組小鼠腎臟病理變化：正常對照組小鼠腎小球呈球形，未見腫脹或萎縮，腎小球細(xì)胞數(shù)量未見增多，系膜基質(zhì)無增生，腎小球囊腔無擴(kuò)大或縮小。近端小管和遠(yuǎn)端小管管腔無腫脹。LN組小鼠部分腎小球彌漫性腫脹增大，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，內(nèi)皮下可見嗜復(fù)紅物質(zhì)沉積，部分腎小球有白金耳樣改變，球囊粘連，腎小管水腫、壞死，出現(xiàn)蛋白管型，腎

9、間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤，較正常對照組病變明顯加重。與模型組相比，干預(yù)組小鼠腎臟病變均較LN組有所減輕，其中以LEF組、TG組病變最輕，病理改變相似。（4）各組小鼠腎組織中HMGB-1、TGF-β1的表達(dá)：HMGB-1在正常對照組小鼠腎組織中表達(dá)較少，主要分布于遠(yuǎn)曲小管、集合管，近曲小管表達(dá)較少，而在腎小球內(nèi)基本無表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示：LN組小鼠腎臟組織中HMGB-1的表達(dá)與正常對照組比較明顯增強(qiáng)（P<0.01）；干預(yù)組較LN組小鼠腎臟組織

10、中HMGB-1的表達(dá)均明顯減弱（P<0.01或P<0.05），其中TG組HMGB-1減弱程度較Pred組更明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TG組與LEF組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。正常對照組小鼠僅在少數(shù)腎小管有微弱TGF-β1表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示：LN組小鼠腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)與正常對照組比較明顯增強(qiáng)（P<0.01）；干預(yù)組較LN組小鼠腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)均明顯減弱（P<0.01或P<0.05）。其中TG組FG

11、F-β1減弱程度較Pred組更明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TG組與LEF組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：（1）本研究成功復(fù)制了cGVHD狼瘡樣腎炎小鼠模型。（2）HMGB-1和TGF-β1在cGVHD狼瘡樣腎炎小鼠腎組織中明顯高表達(dá)，提示HMGB-1和TGF-β1可能共同參與了LN的發(fā)生發(fā)展過程。（3）中藥雷公藤有效成分TG及Pred、LEF對小鼠cGVHD狼瘡樣腎炎具有顯著治療作用，可明顯降低模型小鼠的U