IL-17在EAM繼發(fā)的心肌纖維化中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 心肌炎是一種常見(jiàn)的心血管疾病,其中部分患者可能會(huì)發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病,甚至心衰。病毒感染是心肌炎致病最常見(jiàn)的原因,但是其他病原體感染以及自身免疫性疾病也有誘發(fā)心肌炎的可能。Th17細(xì)胞是最經(jīng)典的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞,在自身免疫性疾病中起著重要的作用,其在自身免疫性心肌炎形成過(guò)程中扮演怎樣的角色,正在引起人們的關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道,IL-17是心肌炎繼發(fā)心肌重塑及擴(kuò)張性心肌病的重要因素。然而,IL-17及產(chǎn)生IL-

2、17的細(xì)胞促進(jìn)心肌纖維化的機(jī)制尚不十分清楚。
　　 本課題通過(guò)體內(nèi)外兩方面研究闡明IL-17在EAM繼發(fā)的心肌纖維化中的作用及其所依賴(lài)的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型的誘導(dǎo)
　　 根據(jù)文獻(xiàn),用鼠心肌肌球蛋白特定序列氨基酸MyHC614-629混合弗氏完全佐劑于第0天和第7天皮下免疫BALB/c小鼠,建立小鼠EAM模型,無(wú)MyHC614-629的弗氏完全佐劑作為對(duì)照組。通過(guò)

3、心肌病理切片HE染色及天狼星紅膠原染色判斷模型是否成功,評(píng)判炎癥及纖維化程度。收集不同時(shí)期小鼠血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-17水平。
　　 (2)小鼠成纖維細(xì)胞的分離與處理
　　 體外分離和培養(yǎng)小鼠心肌成纖維細(xì)胞,PCR檢測(cè)IL-17受體IL-17RA及RC的表達(dá)。用100ng/mlIL-17刺激心肌成纖維細(xì)胞24h,48h,72h,免疫熒光染色及western blot檢測(cè)Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)情況。<

4、br>　　 (3)IL-17誘導(dǎo)心肌纖維化的分子機(jī)制
　　 以100ng/ml IL-17刺激心肌成纖維細(xì)胞0min,5min,15min,30min,45min,60min,western blot檢測(cè)PKCβ,Erk1/2,p65磷酸化的水平。用10nM PKCβ抑制劑提前2h阻斷該信號(hào)分子后,100ng/mlIL-17刺激心肌成纖維細(xì)胞24h,免疫熒光染色及western blot檢測(cè)Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)情況。
　

5、　 (4)疾病的干預(yù)治療
　　 按(1)中的方法誘導(dǎo)EAM模型,從第14天開(kāi)始隔天尾靜脈注射10ug PKCβ抑制劑,第35天處死;對(duì)照組注射相同劑量DMSO。HE染色及天狼星紅膠原染色檢測(cè)膠原表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)成功建立了小鼠自身免疫性心肌炎模型。EAM模型小鼠心肌內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),炎癥后期成纖維細(xì)胞增生,膠原沉積,心肌細(xì)胞受損,排列紊亂。膠原染色顯示隨病程進(jìn)展心肌纖維化程度逐漸加劇。ELIS

6、A檢測(cè)結(jié)果顯示,炎癥高峰期(21天)小鼠血清中IL-17含量(n=6,623.37±53.08 pg/ml)明顯增高,與PBS對(duì)照組(n=6,97.34±19.37 pg/ml)相比有明顯差異(P<0.05)。
　　 (2)成功分離小鼠心肌成纖維細(xì)胞,其表面表達(dá)IL-17RA及RC。100ng/ml刺激心肌成纖維細(xì)胞24h后,免疫熒光染色及western blot顯示Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯增高,與PBS對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

7、P<0.05)。刺激72h后Ⅰ型及Ⅲ型膠原細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量下降,與PBS對(duì)照組相比無(wú)差異(P>0.05)。
　　 (3)IL-17刺激心肌成纖維細(xì)胞后Western blot結(jié)果顯示PKCβ、Erk1/2、p65分別于15min、30min、45min磷酸化水平達(dá)到最高。PKCβ抑制劑阻斷后,Ⅰ型與Ⅲ型膠原的表達(dá)量明顯減低(P<0.05)。
　　 (4)心肌病理切片HE染色及天狼星紅膠原染色顯示與對(duì)照組相比,PKCβ抑制劑治