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文檔簡介
1、目的:
心肌炎是一種常見的心血管疾病,其中部分患者可能會發(fā)展為擴張型心肌病,甚至心衰。病毒感染是心肌炎致病最常見的原因,但是其他病原體感染以及自身免疫性疾病也有誘發(fā)心肌炎的可能。Th17細胞是最經典的產生IL-17的輔助性T細胞,在自身免疫性疾病中起著重要的作用,其在自身免疫性心肌炎形成過程中扮演怎樣的角色,正在引起人們的關注。有文獻報道,IL-17是心肌炎繼發(fā)心肌重塑及擴張性心肌病的重要因素。然而,IL-17及產生IL-
2、17的細胞促進心肌纖維化的機制尚不十分清楚。
本課題通過體內外兩方面研究闡明IL-17在EAM繼發(fā)的心肌纖維化中的作用及其所依賴的分子機制。
方法:
(1)實驗性自身免疫性心肌炎模型的誘導
根據文獻,用鼠心肌肌球蛋白特定序列氨基酸MyHC614-629混合弗氏完全佐劑于第0天和第7天皮下免疫BALB/c小鼠,建立小鼠EAM模型,無MyHC614-629的弗氏完全佐劑作為對照組。通過
3、心肌病理切片HE染色及天狼星紅膠原染色判斷模型是否成功,評判炎癥及纖維化程度。收集不同時期小鼠血清,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-17水平。
(2)小鼠成纖維細胞的分離與處理
體外分離和培養(yǎng)小鼠心肌成纖維細胞,PCR檢測IL-17受體IL-17RA及RC的表達。用100ng/mlIL-17刺激心肌成纖維細胞24h,48h,72h,免疫熒光染色及western blot檢測Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達情況。<
4、br> (3)IL-17誘導心肌纖維化的分子機制
以100ng/ml IL-17刺激心肌成纖維細胞0min,5min,15min,30min,45min,60min,western blot檢測PKCβ,Erk1/2,p65磷酸化的水平。用10nM PKCβ抑制劑提前2h阻斷該信號分子后,100ng/mlIL-17刺激心肌成纖維細胞24h,免疫熒光染色及western blot檢測Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達情況。
5、 (4)疾病的干預治療
按(1)中的方法誘導EAM模型,從第14天開始隔天尾靜脈注射10ug PKCβ抑制劑,第35天處死;對照組注射相同劑量DMSO。HE染色及天狼星紅膠原染色檢測膠原表達。
結果:
(1)成功建立了小鼠自身免疫性心肌炎模型。EAM模型小鼠心肌內可見淋巴細胞浸潤,炎癥后期成纖維細胞增生,膠原沉積,心肌細胞受損,排列紊亂。膠原染色顯示隨病程進展心肌纖維化程度逐漸加劇。ELIS
6、A檢測結果顯示,炎癥高峰期(21天)小鼠血清中IL-17含量(n=6,623.37±53.08 pg/ml)明顯增高,與PBS對照組(n=6,97.34±19.37 pg/ml)相比有明顯差異(P<0.05)。
(2)成功分離小鼠心肌成纖維細胞,其表面表達IL-17RA及RC。100ng/ml刺激心肌成纖維細胞24h后,免疫熒光染色及western blot顯示Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達明顯增高,與PBS對照組相比有統計學差異(
7、P<0.05)。刺激72h后Ⅰ型及Ⅲ型膠原細胞內表達量下降,與PBS對照組相比無差異(P>0.05)。
(3)IL-17刺激心肌成纖維細胞后Western blot結果顯示PKCβ、Erk1/2、p65分別于15min、30min、45min磷酸化水平達到最高。PKCβ抑制劑阻斷后,Ⅰ型與Ⅲ型膠原的表達量明顯減低(P<0.05)。
(4)心肌病理切片HE染色及天狼星紅膠原染色顯示與對照組相比,PKCβ抑制劑治
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