特異性阻斷肝癌癌蛋白P28-Gankyrin與Rb相互作用的小分子化合物的篩選和功能鑒定.pdf

1、研究背景和目的： Gankyrin是2000年日本科學家Fujita等人應用消減雜交法從人肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)組織高表達的基因中篩選出的一條編碼重復ankyrin(ANK)序列的新基因。我們檢索基因庫后發(fā)現(xiàn)gankyrin與1998年Hori等人發(fā)現(xiàn)的p28 (Nas6p)基因序列完全一致,遂將其命名為p28GANK。癌基因p28GANK編碼的蛋白是人26S蛋白酶體(26S pro

2、teasome)調節(jié)亞單位19S/PA700復合物的一種非ATP酶亞基,其核酸序列中含有5個串聯(lián)排列的ANK重復單位,其保守的ankyrin序列介導蛋白與蛋白間的相互作用。26S蛋白酶體中的20S蛋白小體是降解體內(nèi)某些錯誤折疊蛋白或細胞周期蛋白的場所,目前尚不清楚癌蛋白P28GANK在26S蛋白酶體降解蛋白過程中的具體分子作用機制。 前期研究發(fā)現(xiàn)癌蛋白P28-GANK通過與Rb的直接相互作用,調節(jié)Rb的磷酸化程度,此外,P28G

3、ANK與pRb結合后還可能通過26S蛋白酶體的S6bATP酶促進pRb的降解；或pRb直接與26S蛋白酶體的20S核結合而介導其自身降解。通過以上多種途徑P28GANK調控CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1/E2F-1信號傳導通路,已知該信號轉導通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有相當重要的作用。因此,針對該通路及相關靶點采取干預措施有望成為肝癌治療的新途徑。本論文主要針對CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1

4、/E2F-1信號轉導通路中P28GANK和Rb的相互作用的關鍵區(qū)域和氨基酸,運用計算機輔助藥物設計程序設計特異性阻斷兩者結合的小分子化合物并對其進行生物學功能鑒定。 計算機輔助藥物設計(CADD)涉及化學、生物學、計算機科學、信息學、數(shù)學和物理學等領域,是一門新興的、快速發(fā)展的邊緣學科。它基于藥物及其生物大分了靶標的知識,通過理論模擬和計算來預測受體與配體間的相互作用,從而指導和輔助藥物設計,加快藥物開發(fā)進程。隨著藥物設計理論和

5、方法的不斷發(fā)展和完善,CADD在藥物先導化合物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的過程中起到了日益重要的作用,目前已有不少成功的例子。因此,CADD已被公認為是一種高效的藥物設計手段。前期研究顯示P28GANK主要通過N末端的LxCxE模序與pRb的C端產(chǎn)生特異相互作用,在這段序列進行的突變實驗證實其能影響P28GANK與Rb的結合,而含有LxCxE的多肽也能阻斷P28GANK與Rb的作用,因此推測此處即為P28GANK與Rb的作用部位。 P28GAN

6、K的表面沒有合適的口袋或活性位點,而在Rb上與含有LxCxE模序多肽特異結合的部位有一個位處表面的口袋可用于先導化合物的設計篩選。所以我們選擇Rb作為藥物篩選的靶標,希望能夠找到特異性阻斷P28GANK和Rb結合的小分子化合物。 實驗方法： 1、運用生物信息學的方法在互聯(lián)網(wǎng)上尋找Rb的晶體結構,確定與P28GANK相互作用的空間結構及關鍵氨基酸殘基,并設計虛擬篩選流程； 2、綜合考慮分子量、疏水性、氫鍵受體、氫鍵

7、供體、柔性鍵和環(huán)比度等各方面對含有約26萬個小分子的SPECS200603化合物庫進行類藥性過濾； 3、將符合藥性規(guī)則的分子用DOCK4.0和Glide對接,各取得分排名靠前的10000個化合物,綜合兩者打分最好的1286個化合物； 4、用Autodock3.05進行對接,選取前500個化合物,根據(jù)關鍵結合位點信息直接觀察挑選; 5、經(jīng)綜合評價,選擇100個化合物購買,并最終獲得71個化合物； 6、構建p

8、28GANK-GST融合質粒,在BL21大腸桿菌中誘導表達并純化GST和GST-P28GANK蛋白； 7、構建Rb野生型和針對LxCxE與Rb結合口袋關鍵位點的突變體的真核表達質粒； 8、各Rb突變體質粒瞬轉293T細胞,并用GST-pulldown驗證這些位點在Rb和P28GANK結合中的關鍵性； 9、運用CCK-8的方法按不同的濃度梯度初篩有活性的小分子化合物； 10、對生物學活性比較好的化合物細化濃

9、度梯度,檢測其在不同的肝癌細胞系和正常細胞系中對細胞增殖的影響； 11、運用GST-pulldown方法驗證化合物能否抑制Rb與P28GANK的結合。 結果： 1、通過藥物設計程序確定Rb蛋白與P28GANK相互作用的結構域(口袋)和關鍵氨基陵；運用Rb蛋白的突變體作GST-pulldown,證實構成與p28GANK LxCxE序列結合口袋的709、713、753、756、757、761位點的突變能夠有效抑制Rb

10、與P28GANK的結合,其中,709和713位點尤為關鍵。 2、利用CADD虛擬篩選出大約100個小分子化合物,實際購買獲得71個。 3、利用CCK-8初步篩選出6號小分了化合物能有效地抑制肝癌綱胞的增殖且對正常細胞基本無影響,其EC50為3um,對穩(wěn)定表達P28GANK 的NIH/3T3-p28GANK細胞系有明確的抑制增殖活性,而對NIH/3T3-pcDNA3.1細胞系無作用。 4、通過GST-pulldow