全反式維甲酸作用前后的卵巢癌細(xì)胞COC2中維甲酸受體表達(dá)的改變與意義.pdf

1、卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中的死亡率最高，獲得診斷時大部分病人已經(jīng)處于晚期，盡管進(jìn)行了手術(shù)及術(shù)后化療，總的5年生存率仍為20-30％，大部分病人死于腫瘤復(fù)發(fā)及細(xì)胞毒化療藥物的毒性作用和耐藥。因此，尋找毒副作用小又能延遲腫瘤復(fù)發(fā)的鞏固治療藥物對于卵巢癌的治療十分重要。維甲酸，作為一類經(jīng)典的細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，近來已顯現(xiàn)出其對卵巢上皮性癌的抗增殖、誘分化、促凋亡作用，且具備毒副作用小等優(yōu)點，與我們所要求的相符。本文重點在受體水平觀察全反式維甲

2、酸(All—trans retinoicacid，ATRA)對卵巢癌細(xì)胞株COC2的抑癌作用，并對其機(jī)制進(jìn)行探討。 第一部分全反式維甲酸對卵巢上皮腺癌細(xì)胞株COC2的作用目的觀察不同濃度的全反式維甲酸(ATRA)對卵巢上皮性腺癌細(xì)胞COC2的抑制作用。 方法:將相同條件下培養(yǎng)的相同細(xì)胞密度的30瓶COC2細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成以下幾組進(jìn)行干預(yù)，每組5瓶細(xì)胞：1)對照組；2)ATRA組：分別給予1、5、10、20、30

3、u mol/L的ATRA，在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用直接細(xì)胞計數(shù)法計算一定時期內(nèi)的細(xì)胞密度情況；利用倒置顯微鏡和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果:1．COC2細(xì)胞生長的劑量效應(yīng)變化：通過直接計數(shù)法計算細(xì)胞密度我們發(fā)現(xiàn)，ATRA濃度在1-20 μmol/L之間，隨ATRA給藥濃度的增加，COC2細(xì)胞的細(xì)胞密度逐漸下降，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)2．倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：在72小

4、時內(nèi)鏡下見對照組細(xì)胞已有重疊生長，1μmol/L加藥組72小時內(nèi)鏡下與對照組無明顯差異，5－20μmol/L濃度組細(xì)胞隨濃度增加密度下降明顯，在30μmol/L加藥組隨時間延長而細(xì)胞碎片明顯增多，至72小時后無明顯存活細(xì)胞。3．電鏡下觀察腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化：電鏡下見對照組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大，核仁明顯，胞質(zhì)少，胞質(zhì)內(nèi)未見明顯糖原顆粒：經(jīng)ATRA10μmol/L干預(yù)后細(xì)胞胞質(zhì)比例明顯增加，細(xì)胞器較豐富，糖原顆粒易見，還易見凋亡，細(xì)胞核染

5、色質(zhì)邊聚，核固縮呈團(tuán)塊狀，胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)不清，可見細(xì)胞溶解壞死。 結(jié)論:ATRA在有效濃度范圍1-20μmol/L幾之間，隨給藥濃度的增加，COC2細(xì)胞的細(xì)胞密度逐漸下降，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=128.71，P<0.001)，說明ATRA對卵巢癌COC2細(xì)胞有一定的抑制作用。 第二部分實時定量PCR檢測ATRA作用前后的卵巢癌細(xì)胞株COC2中維甲酸受體表達(dá)變化.目的:檢測全反式維甲酸(ATRA)作用前后的卵巢癌

6、COC2細(xì)胞中維甲酸受體RARot mRNA和RXRot mRNA的表達(dá)改變情況，從分子生物學(xué)水平探討全反式維甲酸對卵巢癌細(xì)胞的作用。方法:將卵巢癌細(xì)胞COC2按加藥干預(yù)情況進(jìn)行分組，1)對照組；2)干預(yù)組：分別給予1、5、10、20u mol/L的ATRA進(jìn)行加藥干預(yù)，置入相同條件下培養(yǎng)，72小時后分別提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，利用實時定量PCR方法檢測經(jīng)不同濃度的ATRA干預(yù)前后的卵巢癌COC2細(xì)胞中維甲酸受體RARα和RX

7、RαmRNA的表達(dá)，在ABI—PRISM 7000全自動熒光定量PCR儀上得到各實驗組RARαmRNA、RxRαmRNA及GAPDH 的擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及Ct值，根據(jù)公式計算得出濃度值，各實驗組濃度值與GAPDH濃度值之比即為各組相對定量。 結(jié)果 1．從擴(kuò)增曲線看出，對照組卵巢癌細(xì)胞中RARαmRNA擴(kuò)增起始時間晚，熒光值最低，隨ATRA加藥濃度逐漸增加，其擴(kuò)增起始時間及熒光值逐漸增加，說明對照組卵巢癌細(xì)胞中RARαmRNA

8、表達(dá)極低，ATRA干預(yù)后其表達(dá)增高，且在一定范圍內(nèi)隨加藥濃度增加而增高；而RXRαmRNA結(jié)果正相反，對照組卵巢癌細(xì)胞中RXRαmRNA擴(kuò)增起始時間早，熒光值高，說明對照組卵巢癌細(xì)胞中RXRαmRNA表達(dá)較高，ATRA干預(yù)后其表達(dá)降低，且在一定范圍內(nèi)隨加藥濃度增加而降低。2．從標(biāo)準(zhǔn)曲線看到，起始模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，說明定量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。3．將各干預(yù)組相對定量與對照組進(jìn)行比較得出，各干預(yù)組的細(xì)胞中，RARαmRNA的表

9、達(dá)與對照組相比均升高，當(dāng)濃度達(dá)lOμmol/L時，差異有顯著意義(P=0.002，)，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨加藥濃度增加，RARαmRNA的表達(dá)亦有所增加。與此相反，各干預(yù)組的細(xì)胞中，RXRαmRNA的表達(dá)與對照組相比均降低，且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，隨藥物濃度增大，RXRαmRNA的表達(dá)逐漸降低。 討論:RARαmRNA在卵巢癌COC2細(xì)胞中的基礎(chǔ)含量極低，經(jīng)ATRA干預(yù)后，RARαmRNA的表達(dá)可上調(diào)(F=5.81

10、4，P=0.011)，當(dāng)ATRA濃度達(dá)10μmol/L時，差異有顯著意義(P=0.002)，這種受體表達(dá)的上調(diào)激活了核受體產(chǎn)生ATRA的生物效應(yīng)，因此可認(rèn)為維甲酸對卵巢癌敏感細(xì)胞株產(chǎn)生作用是通過RARα受體而實現(xiàn)的，RARα可能是研究維甲酸對卵巢上皮性癌的作用機(jī)制的最好標(biāo)志物之一；而RXRot mRNA基礎(chǔ)含量極高，經(jīng)ATRA干預(yù)后其表達(dá)減少(E=115.275，P<0.001)，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，隨藥物

11、濃度增大，RXRα，mRNA 的表達(dá)逐漸降低。這一受體表達(dá)改變是否與癌細(xì)胞內(nèi)缺乏RARα，使RXRα代償性增加而形成RXRα/RXRα同二聚體進(jìn)行彌補有關(guān)，在天然的維甲酸化合物中，ATRA或9-cis-RA(9順式維甲酸)均能激活RAR，而只有9-cis-RA可同時激活RXR，我們是否可以認(rèn)為，由于ATRA僅為RAR的有效配體，隨ATRA濃度的增加，RARα的表達(dá)逐漸增加，故需要越來越多的RXRα與之結(jié)合形成異二聚體來發(fā)揮生物效應(yīng)，因此