血脂紊亂對(duì)C57BL-6小鼠外周神經(jīng)病變的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、[背景]
　　 目前，糖尿病的患病率急劇上升。依據(jù)不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)，至少50％～90％的糖尿病患者將會(huì)發(fā)生糖尿病神經(jīng)病變。糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，其最常見的形式是遠(yuǎn)端對(duì)稱性多神經(jīng)病變，多從下肢開始，由遠(yuǎn)端到近端，對(duì)稱性地發(fā)生神經(jīng)功能的缺失，呈現(xiàn)手套、襪套樣分布。有統(tǒng)計(jì)顯示，糖尿病確診后的25年內(nèi)發(fā)生下肢截肢的累積風(fēng)險(xiǎn)率為22％，人群中

2、60％的下肢截肢是由糖尿病神經(jīng)病變所致，每年花費(fèi)超過(guò)220億美元，患者的生活質(zhì)量顯著下降。糖尿病周圍神經(jīng)病變不僅危害人類健康，也對(duì)整個(gè)社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，預(yù)防和治療糖尿病周圍神經(jīng)病變是一項(xiàng)重要和急迫的公共衛(wèi)生問(wèn)題，需要更深入地研究其發(fā)病機(jī)制。
　　 高血糖是糖尿病神經(jīng)病變發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)誘導(dǎo)系統(tǒng)和神經(jīng)的氧化應(yīng)激明確的導(dǎo)致外周神經(jīng)損傷。良好的血糖控制可以減少糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病率，但資料顯示單單控制血糖并不能有效

3、阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。越來(lái)越多的研究顯示出血脂異常在糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。這可能解釋2型糖尿病患者相對(duì)于1型糖尿病患者更早地發(fā)生神經(jīng)病變。血脂異常常出現(xiàn)在2型糖尿病早期，并與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生相關(guān);而1型糖尿病患者在初診糖尿病時(shí)血脂水平一般正常，而在病程后期往往會(huì)出現(xiàn)血脂異異常，并且這異常的血脂水平與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生和發(fā)展的延遲是一致的。一些針對(duì)2型糖尿病患者的大型臨床研究也指出早期的血脂異常是發(fā)生糖尿病神經(jīng)病變

4、主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，糖尿病周圍神經(jīng)病變的病因尚未闡明，仍缺乏有效的治療手段。但臨床和基礎(chǔ)研究逐漸達(dá)成共識(shí)，氧化應(yīng)激是糖尿病微血管并發(fā)癥包括糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病基礎(chǔ)。對(duì)于1型糖尿病患者，微血管病變的嚴(yán)重程度平行于系統(tǒng)氧化應(yīng)激的程度，隨著疾病的進(jìn)展，抗氧化能力下降而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加。對(duì)于2型糖尿病患者也有類似的氧化應(yīng)激表現(xiàn)，并與微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。增強(qiáng)的氧化應(yīng)激存在于外周神經(jīng)，足背和交感神經(jīng)

5、節(jié)以及外周神經(jīng)系統(tǒng)的脈管系統(tǒng)，并涉及神經(jīng)血管功能障礙，運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度缺陷，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持受損，神經(jīng)代謝和信號(hào)傳導(dǎo)改變以及糖尿病特征性的形態(tài)學(xué)異常。
　　 12/15-脂加氧酶(12/15-lipoxygenase，12/15-LOX)是細(xì)胞內(nèi)非血紅素加雙氧酶，它氧化脂蛋白和磷脂中酯化了的花生四烯酸形成具有生物學(xué)活性的類二十烷酸。12/15-脂加氧酶上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)受損，氧化-硝化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。近年來(lái)研究認(rèn)為該酶與糖尿

6、病神經(jīng)病變有關(guān)。Stavriichuk等發(fā)現(xiàn)12/15-脂加氧酶過(guò)表達(dá)和激活導(dǎo)致外周神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)硝化應(yīng)激，并促進(jìn)糖尿病前期和糖尿病相關(guān)的神經(jīng)病變的發(fā)展。有研究證實(shí)12/15-脂加氧酶與運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，小的感覺(jué)神經(jīng)纖維功能障礙和DPN特征性的大的有髓神經(jīng)纖維的軸突萎縮相關(guān)。
　　 越來(lái)越多的臨床研究證實(shí)血脂異常與DPN的發(fā)展相關(guān)聯(lián)，但尚需進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究支持。本研究探討高脂飲食誘導(dǎo)血脂紊亂的小鼠外周神經(jīng)功能的改變及其可

7、能機(jī)制，為早期DPN的預(yù)防和治療提供新的思路。通過(guò)測(cè)定熱痛覺(jué)閾值和神經(jīng)傳導(dǎo)速度評(píng)估高脂飲食誘導(dǎo)血脂紊亂的C57BL/6小鼠外周神經(jīng)功能的改變。此外，通過(guò)觀察血清氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)以及坐骨神經(jīng)12/15-脂加氧酶表達(dá)的改變探討血脂紊亂對(duì)C57BL/6小鼠發(fā)生外周神經(jīng)病變的可能作用機(jī)制。
　　 第一章血脂紊

8、亂對(duì)C57BL/6小鼠外周神經(jīng)病變的影響
　　 [目的]
　　 觀察高脂飲食誘導(dǎo)血脂紊亂的C57BL/6小鼠外周神經(jīng)功能的改變。
　　 [方法]
　　 1、3周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常飲食組和高脂飲食組，每組10只小鼠，自由進(jìn)水。
　　 2、觀察小鼠一般情況，并每周定期稱重，記錄體重變化。
　　 3、自分組喂養(yǎng)第6周起，隔周行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)?？崭?小時(shí)后，采集鼠尾一滴血并用

9、標(biāo)準(zhǔn)血糖儀測(cè)定空腹血糖值。小鼠清醒狀態(tài)下按1g/kg體重腹腔內(nèi)注入葡萄糖，測(cè)定注入后第30，60和120分鐘的血糖值。以血糖曲線下面積表示糖耐量。計(jì)算血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，以超過(guò)正常對(duì)照組小鼠AUC的-x±3s為診斷糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 4、當(dāng)高脂飲食組小鼠出現(xiàn)糖耐量異常時(shí)行外周神經(jīng)功能學(xué)檢測(cè)。將小鼠放在（55±0.5℃）恒溫電熱板上，以小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后趾的平均反應(yīng)時(shí)間作為

10、熱痛覺(jué)閾值來(lái)評(píng)估小鼠對(duì)熱有害刺激的敏感性。每只小鼠重復(fù)測(cè)定4次取平均值，每次測(cè)定至少間隔10分鐘。
　　 5、聯(lián)合氯胺酮(100mg/kg)和乙酰丙嗪(10mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，并使其體溫維持在32-34℃。采用澳洲AD公司powerlab/8s多用生理記錄儀測(cè)定。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)=兩刺激電極與記錄電極之間傳導(dǎo)距離之差/兩刺激電極與記錄電極之間傳導(dǎo)潛伏期之差，感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)=刺激電極與記錄電極

11、之間距離/潛伏期。每只小鼠重復(fù)測(cè)定3次取平均值，每次測(cè)定至少間隔15分鐘。
　　 6、過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠。EP管收集血標(biāo)本，4℃下1500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，分離血清，-80℃保存待檢。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low den

12、sity lipoprotein，LDL-C)。
　　 7、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、分組喂養(yǎng)14周后，高脂飲食組小鼠體重較正常對(duì)照組升高29.09％(t=-5.804，P=0.000)，而兩組隨機(jī)血糖無(wú)顯著性差異(t=-2.055，P=0.055)。
　

13、　 2、第14周時(shí)，高脂飲食組小鼠腹腔內(nèi)注射葡萄糖后第30min和60min血糖濃度均高于正常組(t=-3.844，P＜0.001;t=-2.511，P=0.022)，而兩組空腹血糖及第120min血糖濃度并無(wú)顯著性差異(t=-1.989，P=0.062; t=-2.023，P=0.058)。計(jì)算血糖曲線下面積，高脂飲食組小鼠出現(xiàn)糖耐量異常(t=-3.625，P=0.002)。
　　 3、在熱板試驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，高脂飲

14、食組小鼠對(duì)熱有害刺激反應(yīng)的潛伏期明顯縮短(t=2.313，P=0.033)。
　　 4、與正常對(duì)照組相比，高脂飲食組小鼠運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢(t=2.430,P=0.026;t=2.527,P=0.021)。
　　 5、血清TC、HDL-C、LDL-C分別較正常對(duì)照組升高86.99％、38.0％、85.42％(t=-12.676，P=0.000; t=-8.061，P=0.000; t=-12.794，P=0.

15、000)，而TG無(wú)顯著性差異(t=-1.502，P=0.151)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠成功構(gòu)建血脂紊亂動(dòng)物模型。
　　 2、血脂紊亂的C57BL/6小鼠在尚未出現(xiàn)糖尿病的階段已經(jīng)出現(xiàn)了外周神經(jīng)功能的改變，類似于人類糖尿病前期或肥胖階段外周神經(jīng)病變的特點(diǎn)，提示血脂紊亂可能是糖尿病周圍神經(jīng)病變的風(fēng)險(xiǎn)因素，早期行降脂治療可能有助于阻止或延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)展。
　　

16、第二章血脂紊亂的C57BL/6小鼠發(fā)生外周神經(jīng)病變的機(jī)制初探
　　 [目的]
　　 觀察血清氧化應(yīng)激指標(biāo)和坐骨神經(jīng)12/15-脂加氧酶表達(dá)的改變，探討血脂紊亂的C57BL/6小鼠發(fā)生外周神經(jīng)病變的可能機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1、血清T-SOD和MDA測(cè)定分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法。
　　 2、迅速分離坐骨神經(jīng)，液氮中冰凍，-80℃保存待檢。應(yīng)用蛋白免疫印跡法(western bl

17、ot)檢測(cè)12/15-LOX蛋白的表達(dá)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、與正常對(duì)照組相比，高脂飲食組小鼠血清T-SOD活性和MDA含量均顯著增加(t=-2.278，P=0.035; t=-2.6967，P=0.020)。
　　 2、高脂飲食組小鼠坐

18、骨神經(jīng)12/15-LOX蛋白含量明顯高于正常對(duì)照組(t=-8.135，P=0.001)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、高脂飲食組小鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激，提示氧化損傷可能是導(dǎo)致血脂紊亂的C57BL/6小鼠出現(xiàn)外周神經(jīng)病變的重要因素，從而抗氧化治療在早期糖尿病周圍神經(jīng)病變中的應(yīng)用可能有積極意義。
　　 2、血脂紊亂的C57BL/6小鼠坐骨神經(jīng)12/15-脂加氧酶過(guò)表達(dá)和激活，提示該酶可能參與了外周神經(jīng)病變的發(fā)生，因此可能