新基因VSTM1-v2對C57BL-6小鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎的影響.pdf

1、目的:隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)面臨的重要任務(wù)就是如何將基因組序列信息轉(zhuǎn)化為基因的功能信息，了解生命活動的分子機理，改善人類健康?；诨蚪M計劃，人們根據(jù)潛在的細胞因子的表達以及結(jié)構(gòu)特點選定它們的編碼基因。VSTM1（V-setandtransmembranedomaincontaining1）就是這樣的基因，它定位于人染色體19q13.42，沒有任何功能報道。VSTM1有5種表達形式，VSTM1-v1和VSTM1-v2是其主要

2、的表達形式，其中VSTM1-v2為經(jīng)典分泌的糖蛋白，主要表達于免疫組織和細胞。我們教研室與北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部合作研究新基因的開發(fā)和探索，通過巢式PCR篩選出VSTM1是與炎癥相關(guān)的基因。肺炎克雷伯桿菌Kp（Klebsiellapneumoniae）是目前較為常見的醫(yī)院內(nèi)機會致病菌。當(dāng)機體免疫低下時，可引起多種感染。隨著頭孢菌素類抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床分離的肺炎克雷伯桿菌耐藥性日漸嚴(yán)重，現(xiàn)已成為防治的難點。本文通過建立C57BL/6小鼠肺炎克

3、雷伯桿菌肺炎模型，研究VSTM1-v2在炎癥中的作用，并且對其進行深入研究將具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　 方法:細菌培養(yǎng):肺炎克雷伯桿菌，取自臨床患者痰培養(yǎng)。經(jīng)LB培養(yǎng)皿培養(yǎng)后取單菌落至液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7～11h。動物模型建立:將肺炎克雷伯桿菌培養(yǎng)7～11h，取單菌落溶于生理鹽水并調(diào)整濃度為107cfu/ml，取20μl注射于小鼠氣管激發(fā)肺炎。動物處理:取88只C57BL/6小鼠隨機分為VSTM1-v2處

4、理組(40只)，生理鹽水對照組（40只）和正常組（8只）。正常組不做任何處理。VSTM1-v2處理組小鼠尾靜脈注射100μlVSTM1-v2(1ng/μl)，生理鹽水對照組小鼠尾靜脈注射同等體積的生理鹽水，一小時后這兩組小鼠氣管內(nèi)注射20μl濃度為107cfu/ml肺炎克雷伯桿菌。檢測方法:注射克雷伯桿菌后3h，6h，12h，24h采集標(biāo)本。取肺組織進行病理學(xué)檢查包括肺組織大體觀察、HE染色以及免疫組織化學(xué)染色檢測，實時熒光定量PCR檢

5、測炎性相關(guān)的細胞因子變化和免疫蛋白印跡檢測趨化因子GROalpha(belongstotheintercrinealpha(chemokineCxC)family)蛋白表達量，肺組織髓過氧化物酶(MPO)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性分析，以及取外周血流式細胞術(shù)微球陣列法檢測細胞因子。
　　 結(jié)果:
　　 VSTM1-v2處理組與生理鹽水對照組比較，結(jié)果如下:
　　 1.VSTM1-處理組小鼠的病理報告顯示

6、，肺組織大體觀呈淡紅色，肺紋理較陽性對照組清晰，肺部炎癥減輕;肺組織HE染色觀察到組織炎性滲出比生理鹽水對照組少，免疫組織化學(xué)染色顯示細胞因子IL-6和TNF-a表達減少。
　　 2.蛋白免疫印跡法提示GRO蛋白表達量比生理鹽水對照組減少。
　　 3.實時熒光定量PCR檢測到肺組織細胞因子IL-6，IL-1β，TNF-α，CXCR2andMIP-2mRNA表達量比生理鹽水對照組明顯減少。
　　 4.流式細胞術(shù)微球