pCXN2-mIZUMO對小鼠C57BL-6生育能力的影響.pdf

1、【背景與目的】尋找方便而高效的手段來對人類進行計劃生育和控制某些有害動物的數量一直是科學家們感興趣的課題。隨著基因工程和免疫學技術的發(fā)展,應用免疫避孕疫苗控制人或動物的生育能力成為很多國家、尤其是發(fā)展中國家研究的重點。不同于傳統(tǒng)意義上的感染性疾病疫苗,免疫避孕疫苗是人為地干擾正常健康機體的生殖生理過程。而基因免疫是20世紀90年代發(fā)展起來的一種新的免疫技術,是將抗原基因重組到真核表達載體上,經過一定的方法轉染到動物機體細胞內,表達的抗原

2、經過抗原提呈激活機體免疫系統(tǒng),從而誘導產生特異性的體液免疫和/或細胞免疫應答。2005年3月,日本學者Naokazu Inoue等人第一次發(fā)現(xiàn)了Izumo蛋白,并證實這種蛋白在精卵融合中起關鍵作用,敲除了Izumo基因的精子由于喪失了與卵子質膜融合的能力而使小鼠完全失去了生育能力。本研究通過應用基因免疫的原理及方法,研究了IZUMO基因在小鼠C57BL/6肌肉中的表達及對其生育能力的影響,為進一步研究人類和其他動物生育控制方法提供實驗依

3、據。
　　【材料和方法】1)材料①重組質粒pCXN2-mIZUMO;②對照質粒pCXN2;③成熟雌性和雄性C57BL/6小鼠,6-8周齡;④抗血清,取自被免疫后的C57BL/6小鼠;⑤精子,取自成熟雄性C57BL/6小鼠附睪;⑥卵母細胞,取自經超排后的成熟雌性C57BL/6小鼠輸卵管。2)方法①構建對照質粒pCXN2,用酶切法鑒定對照質粒是否構建成功;②重組質粒pCXN2-mIZUMO和對照質粒pCXN2 DNA的提取和純化;③實

4、驗動物C57BL/6小鼠的免疫前預處理:每次免疫前用0.25％鹽酸布比卡因多點注射實驗動物左后腿脛前肌,提高DNA的攝取效率。3天后在同一部位進行DNA免疫;④實驗動物C57BL/6小鼠的免疫:將實驗動物隨機分成兩組,分別用重組質粒pCXN2-mIZUMO和對照質粒pCXN2免疫小鼠;⑤血清的制備:每次免疫前和最后一次免疫完成后2周從尾靜脈取血制備血清;⑥RT-PCR檢測pCXN2-mIZUMO在小鼠體內的表達;⑦ELISA法測定血清中

5、抗 Izumo抗體的滴度;⑧體外受精(IVF)實驗檢測抗血清在體外的作用;⑨實驗動物合籠后統(tǒng)計產仔數,分析免疫對小鼠生育能力的影響。
　　【結果】①酶切鑒定用EcoRⅠ行單酶切,HindⅢ和XbaⅠ行雙酶切,分別對重組質粒pCXN2-mIZUMO和構建的對照質粒 pCXN2進行酶切鑒定,均得到相應的特異性片段。說明對照質粒構建成功,重組質粒正確無誤;②RT-PCR用1%的瓊脂糖凝膠電泳得到RT-PCR產物為468 bp,產物堿基測

6、序結果經 BLAST比對分析后證實為 C57BL/6小鼠Izumo的特異性mRNA片斷,說明質粒pCXN2-mIZUMO在小鼠的體內可以表達;③ELISA檢測重組質粒 pCXN2-mIZUMO第一次免疫小鼠后2周即可檢測到抗 Izumo特異性抗體,經過二次加強免疫后抗體水平從0~6周持續(xù)升高并維持在較高的水平;④體外受精試驗實驗組受精率為11.6%,對照組受精率為25.2%,統(tǒng)計分析表明差異有統(tǒng)計學意義,P<0.05;⑤實驗動物合籠免疫

7、雌鼠與正常雄鼠交配,實驗組與對照組間產仔數的差異具有統(tǒng)計學意義,P<0.05;而免疫雄鼠與正常雌鼠交配,實驗組與對照組的產仔數無統(tǒng)計學差異。
　　【結論】①對照質粒pCXN2構建成功;②重組質粒pCXN2-mIZUMO可以在小鼠骨骼肌細胞中表達;③經重組質粒pCXN2-mIZUMO免疫的小鼠體內誘發(fā)了抗Izumo特異性免疫應答。;④經重組質粒pCXN2-mIZUMO免疫后的小鼠抗血清在體外可以降低其受精率;⑤經重組質粒pCXN2-