大鼠脂肪干細(xì)胞（ADSCs）的培養(yǎng)、向神經(jīng)細(xì)胞的分化以及BDNF基因和其受體trkB的表達(dá).pdf

1、目的：證實(shí)能從大鼠脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞(ADSCs)，并通過體外培養(yǎng)觀察其在形態(tài)、生長方式以及貼壁率、生長曲線等生物學(xué)特征。借鑒骨髓干細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化的誘導(dǎo)模式并進(jìn)行改良，證明能夠以此誘導(dǎo)ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，以及得到其分化成為細(xì)胞的具體特征。在其預(yù)誘導(dǎo)階段動態(tài)觀察神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志Ncstin的表達(dá)情況，試圖闡述ADSCs的分化機(jī)制與中間過程。最后，對比ADSCs分化前后細(xì)胞的BDNF基因和BDNF的特異受體tr

2、kB的表達(dá)水平的變化。希望能夠證明ADSCs是一種具有自我復(fù)制并連續(xù)傳代、可分化為神經(jīng)細(xì)胞并具備執(zhí)行神經(jīng)細(xì)胞某種功能的能力的成體干細(xì)胞。 方法：第一章從健康S-D大鼠的腹股溝和腹膜后取出脂肪組織，結(jié)合機(jī)械分離和消化法分離出ADSCs，并接種于15﹪FBS BMDM培基中。相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，并進(jìn)行傳代。取第三代細(xì)胞測定其貼壁率、MTT比色法描繪生長曲線，免疫熒光法鑒定干細(xì)胞標(biāo)志物CD44。第二章首先通過兩步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)ADSC

3、s向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，免疫熒光法檢測分化后細(xì)胞’NSE、GFAP的表達(dá)情況，以明確分化結(jié)果。再次，在分化過程中觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，免疫組化檢測Nestin的動態(tài)變化，驗(yàn)證ADSCs分化與神經(jīng)干細(xì)胞的關(guān)系。第三章通過RT-PCR檢測ADSCs分化前后BDNF基因表達(dá)的變化以及免疫組化檢測其受體trkB表達(dá)水平的變化，結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異性分析。 結(jié)果：從大鼠的脂肪組織中可成功提取ADSCs，其呈貼壁式生長，貼壁

4、速度快，形態(tài)為梭狀，在含血清培養(yǎng)中能夠連續(xù)傳代并穩(wěn)定增殖，而且ADSCs強(qiáng)烈表達(dá)CD44，符合脂肪干細(xì)胞的命名。經(jīng)神經(jīng)祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基和巰基乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)后，大部分ADSCs可分化表達(dá)NSE的神經(jīng)元，而未見星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表面標(biāo)志GFAP的表達(dá)。分化過程中Nestin表達(dá)水平經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后呈逐漸下降趨勢從21.83﹪到9.10﹪，認(rèn)為ADSCs的分化不經(jīng)歷神經(jīng)干細(xì)胞的中間過程，可能是前者僅分化為神經(jīng)元而不向膠質(zhì)細(xì)胞分化的原因。在分化結(jié)束后

5、，BDNF基因轉(zhuǎn)錄水平較分化前顯著提高，而且該基因產(chǎn)物BDNF的酪氨酸激酶型受體trkB在蛋白水平的表達(dá)亦平行升高，說明除形態(tài)學(xué)和表型的“神經(jīng)化”外，ADSCs分化成的細(xì)胞也具有了相當(dāng)執(zhí)行和介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞功能的能力。結(jié)論：ADSCs具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力和定向分化為神經(jīng)元的生物學(xué)特性，分化后在形態(tài)、表型和功能三個層面上同時表現(xiàn)出了顯著變化，可以成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷、退行性疾病的較為理想的成體干細(xì)胞，其用途包括神經(jīng)元的替代和成為外源基因或藥