龍葵多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗H22腫瘤活性研究.pdf

1、龍葵(Solanum nigrum L.)為茄科茄屬植物龍葵的干燥全草,有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、止咳祛痰等功效。廣泛用于治療癌癥、炎癥、痢疾、感冒發(fā)熱、牙痛、功能性子宮出血、毒蛇咬傷、疔瘡、帶狀皰疹等多種疾病。文獻(xiàn)報道,龍葵多糖具有抗腫瘤活性,目前對龍葵多糖的研究側(cè)重于粗多糖,對其均一多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的報道稀少,為系統(tǒng)的研究龍葵多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性,對龍葵多糖進(jìn)行了分離純化、理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析及抗腫瘤活性的研究。

2、r>　　 本文主要由四個部分組成,包括龍葵多糖的分離純化、理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析、抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究。主要工作及研究結(jié)果如下:
　　 第一部分:龍葵多糖的分離純化研究。包括:
　　 1.采用水提和堿提法從龍葵中分別獲得水溶性多糖和堿溶性多糖,并對兩種多糖進(jìn)行脫蛋白工藝和脫色研究,結(jié)果表明鹽酸法脫蛋白效果最好,有高的脫蛋白率和低的多糖損失率。經(jīng)D-900大孔吸附樹脂脫色,脫色率在70％以上。經(jīng)脫蛋白及脫色處理,獲得精制

3、多糖SNLWP和SNLAP,其得率分別為3.87％、6.04％。
　　 2.多糖SNLWP和SNLAP分別經(jīng)DEAE Cellouse-52離子交換纖維素柱分離,SephadexG-100凝膠柱層析純化,得到4個主要組分SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1和SNLAP-2,它們分別占精多糖總量的51.47％、11.62％、7.79％和34.39％。4個組分經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、SephadexG-100凝膠柱層析、HPGP

4、C3種方法鑒定,表明均為均一多糖。
　　 第二部分:龍葵多糖均一組分理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析。包括:
　　 1.龍葵均一多糖SNLWP-1、SNLAP-1為白色粉末,SNLWP-2、SNLAP-2為淡黃色粉末,4種均一多糖均易溶于水和DMSO。苯酚-硫酸反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、斐林反應(yīng)的鑒定結(jié)果表明:4種均一多糖均為非淀粉類多糖,不含有還原性糖。采用HPGPC進(jìn)行分子量測定,SNLWP-1和SNLAP-1分子量分別為14125和

5、9120,SNLWP-2、SNLAP-2分子量均大于1600000。
　　 2.柱前衍生化-氣質(zhì)聯(lián)用法測定多糖的單糖組成,結(jié)果表明:SNLWP-1由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖組成,摩爾比為1.8:1:1.2:2。SNLWP-2由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖組成,摩爾比為5.4:10.4:1.4:1:1.6。SNLAP-1由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖組成,摩爾比為28:1:6:51:13。SNLAP-2

6、由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖組成,摩爾比為5.8:1:1.3:2.6:2。
　　 3.紅外光譜分析結(jié)果表明:4種均一多糖均含有多糖的特征吸收峰,其中SNLWP-1、SNLAP-1、SNLAP-2為β-構(gòu)型。SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2由吡喃糖苷和呋喃糖苷組成。
　　 4.剛果紅實驗結(jié)果表明:龍葵均一多糖SNLWP-1、SNLAP-1、SNLAP-2可能存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。SNL

7、WP-2則不存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。
　　 第三部分:龍葵多糖抗腫瘤活性研究。包括:
　　 1.以H22腹水瘤小鼠為模型,龍葵多糖SNLWP、SNLAP按不同劑量灌胃給藥,測定小鼠生存時間、腹腔腹水量、體重及免疫臟器重量,結(jié)果表明:兩種精多糖均對H22腹水瘤小鼠有一定的生命延長作用,對其惡性腹水有一定的抑制作用,并能提高其免疫臟器指數(shù),且呈劑量依賴關(guān)系,并對小鼠體重?zé)o明顯影響。SNLWP(200 mg/kg·d、100 mg/

8、kg·d)和SNLAP(200 mg/kg·d、100 mg/kg·d)給藥組小鼠的生命延長率分別達(dá)到66.3％、61.2％和97.4％、63.7％；SNLWP(200 mg/kg·d、100 mg/kg·d)和SNLAP(200mg/kg·d、100 mg/kg·d)對腹水瘤小鼠惡性腹水的抑制率分別為46.2％、30.8％和58.7％、37.4％； SNLWP和SNLAP能顯著提高腹水瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。實驗結(jié)果表明SNLWP

9、和SNLAP對H22腹水瘤小鼠有抗腫瘤療效且無毒副作用,其抗腫瘤作用可能與提高免疫功能有關(guān)。
　　 2.以H22腹水瘤小鼠為模型,龍葵均一多糖SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2按不同劑量灌胃給藥,測定小鼠生存時間、腹腔腹水量、體重及免疫臟器重量,結(jié)果表明:其中SNLWP-1、SNLAP-1和SNLAP-2能顯著抑制荷瘤小鼠惡性腹水的生成,延長其生命率,且呈劑量依賴關(guān)系,并對小鼠體重?zé)o明顯影響。SNLW

10、P-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)給藥組小鼠的生命延長率分別達(dá)到63.5％、36.5％,75.9％、64.2％,88.3％、73.7％。SNLWP—1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/

11、kg·d、100 mg/kg·d)對惡性腹水的抑制率分別達(dá)到68.7％、57.8％,65.4％、63.6％,69.5％、66.8％。實驗結(jié)果顯示SNLWP-1、SNLAP-1和SNLAP-2對H22腹水瘤小鼠有抗腫瘤療效且無毒副作用。
　　 第四部分:龍葵多糖抗腫瘤機(jī)制研究。包括:
　　 1.以半數(shù)抑制濃度(IC50)為指標(biāo),采用改良MTT法系統(tǒng)的考察了龍葵水提及堿提精多糖SNLWP、SNLAP,龍葵均一多糖SNLWP-

12、1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2對小鼠肝癌細(xì)胞H22的增殖抑制作用。結(jié)果表明,龍葵精多糖及其均一多糖對H22細(xì)胞基本無抑制作用。由此可得出,龍葵多糖對H22細(xì)胞無直接的細(xì)胞毒作用,抗腫瘤作用,可能主要是通過機(jī)體自身調(diào)節(jié)作用,增強機(jī)體免疫力而間接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞。
　　 2.以H22腹水瘤小鼠為模型,龍葵均一多糖SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2按不同劑量灌胃給藥,測定小鼠免疫臟器重

13、量和血清中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10含量,實驗結(jié)果顯示:SNLWP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)能顯著提高腹水瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。SNLWP-1(100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·

14、d、100 mg/kg·d)能顯著提高治療組小鼠外周血血清中IL-2、IFN-γ水平,降低IL-10水平。
　　 IL-2、IFN-γ及IL-10在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,它們對腫瘤細(xì)胞無直接毒性,而是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。IL-2和IFN-γ水平的提高可促進(jìn)小鼠Th1細(xì)胞活化,增強機(jī)體免疫力,IL-10水平的降低抑制Th2細(xì)胞活化,進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞活化,也可增強機(jī)體免疫力,進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的目的。由此可見促進(jìn)