硫醇轉上移酶在皮細胞晚期糖氧化應基化終激中的產(chǎn)物誘表達和導的人作用研晶狀體究.pdf

1、目的：
　　糖尿病持續(xù)高血糖狀態(tài)下，晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）含量相對上升，會誘發(fā)氧化應激反應，可能參與糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。硫醇轉移酶（Thioltransferase，TTase）作為巰基-二硫化物氧化還原酶家族中的成員，對晶狀體氧化還原平衡狀態(tài)的維持具有非常重要的作用。本實驗觀察AGEs對人晶狀體上皮細胞氧化還原狀態(tài)和TTase表達的影響，初步研究在AGE

2、s誘導引發(fā)的氧化損傷中，TTase可能參與的作用機制，為進一步探究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制提供新思路。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞，實驗組采用AGEs-BSA濃度為1.5 mg/ml，10％（v/v）胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；陰性對照組加入相同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），分別于1 d，2 d，3 d，4 d收集細胞，測定細胞內(nèi)ROS含量，SOD，CAT活

3、性，并且測定TTase活性，qRT-PCR技術檢測TTase mRNA表達，Western blot檢測TTase蛋白質的表達情況。
　　2.將前期篩選出來的轉染效率較為理想的TTase siRNA轉染至人晶狀體上皮細胞，測定干擾效率。設立正常對照組，AGEs-BSA組，AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組和AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組，培養(yǎng)2d后測定細胞內(nèi)ROS含量，SOD活性、CAT活性和GSS

4、G/T-GSH。
　　結果：
　　1. AGEs-BSA處理后細胞內(nèi)ROS含量隨著作用時間延長逐漸增高，測得1 d，2 d，3 d，4 d ROS含量分別為：153.67±24.57，180±11.55，268.01±20.50和313.33±35.46相對熒光單位，較正常對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。測得細胞內(nèi)CAT活性于1 d，2 d，3 d，4 d時分別為10.07±0.84，9.27±0.72，

5、7.05±0.88和5.30±1.67 U/mg protein，其中2 d，3 d，4 d較正常對照組有明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），SOD活性于1 d，2 d，3 d，4 d分別為104.21±3.95，92.98±8.98，86.54±3.57和81.56±5.06 U/mg protein，較正常對照組有顯著性下降（P<0.05），CAT與SOD的活性均隨著時間作用延長逐漸下降，BSA對照組與正常對照組無顯著差異

6、。
　　2. AGEs-BSA處理后晶狀體上皮細胞內(nèi)TTase mRNA表達水平增高，于2 d時達到峰值，約為正常對照組的5.06倍（P<0.01）。隨后表達開始下降，3d時為正常對照組的3.53倍（P<0.01）。4 d時繼續(xù)下降，為正常對照組的3.10倍。TTase活性1 d，2 d，3 d，4 d分別為8.03±0.86，10.82±0.51，11.05±0.83，8.63±0.77 mU/mg protein，呈先上升后下

7、降的趨勢。培養(yǎng)至2 d時，為正常對照組的1.53倍，于3 d時，為正常對照組的1.69倍，均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BSA處理組TTase活性于1~4 d未見明顯變化趨勢。AGEs-BSA處理組3 d時TTase蛋白質的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3. ROS含量測定結果在正常對照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組以及 AGEs-BSA+ TTase s

8、iRNA干擾組中，分別為93.33±21.85，190.30±9.84，188.02±19.31和280.32±18.35相對熒光單位，AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組細胞內(nèi)ROS含量與AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。GSSG/T-GSH結果在正常對照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組以及 AGEs-BSA+ TTase siR

9、NA干擾組分別為：(3.20±0.47)%，(11.35±0.62)%，(10.86±1.50)%和(16.45±0.64)%，AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組細胞內(nèi)GSSG/T-GSH最高，與AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組以及 AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組的 SOD活性

10、測定結果分別為119.77±8.42，92.98±8.98，79.78±6.05和54.15±9.06 U/mg protein。CAT活性測定結果分別為15.07±0.78，9.27±0.73，9.01±1.52和4.01±0.94 U/mg protein，AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組細胞SOD和CAT活性與AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對照組比較顯著降低（P<0.05）。
　　結論：