S5a結(jié)合死亡受體6,通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)人單核細胞白血病細胞THP-1的分化.pdf

1、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，因其良好的治療效果和相對較弱的不良反應(yīng)，是近年來針對腫瘤治療，尤其白血病治療的研究熱點。已有的研究證明，angiocidin，利用來源于血小板凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)多肽CSVTCG-瓊脂糖親和層析柱從肺癌細胞中分離得到了一種蛋白質(zhì)，具有誘導(dǎo)THP-1細胞，一種經(jīng)典的單核細胞白血病細胞系，分化為成熟的巨噬細胞的作用。而這些作用可以通過MAPK、NF-κB和PI3K三條信號通路介導(dǎo)實現(xiàn)。S5a，胞內(nèi)26S蛋白酶體

2、亞單位，在蛋白質(zhì)序列上和angiocidin基本一致。本實驗室前期的實驗已證明，S5a可以誘導(dǎo)THP-1細胞分化為巨噬細胞，并且在能夠在THP-1細胞膜上與死亡受體6(Death Receptor6)結(jié)合。但是其結(jié)合活性，結(jié)合方式，以及這種結(jié)合在S5a誘導(dǎo)分化的過程中是否起作用，如何作用，都還未知。本論文將從以下兩個部分，闡述死亡受體6(DR6)在S5a的作用下，介導(dǎo)THP-1細胞分化的機制。
　　 第一部分 S5a和DR6的結(jié)

3、合活性分析。
　　 首先，為了驗證DR6在介導(dǎo)THP-1細胞分化過程中的作用，我們給予DR6干擾RNA，或者可溶性DR6受體，通過對細胞表面標志和細胞吞噬能力的檢測，發(fā)現(xiàn)S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化的能力明顯減弱。這就證明了DR6在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化過程中，發(fā)揮了重要的作用。隨后，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗，證明了DR6和S5a是在高親和力的作用下結(jié)合的，EC50=145±13nM。同時，我們還通過計算機模擬分析了DR6和S

4、5a的相互結(jié)合，并得到了兩種最可能的結(jié)合方式，以及幾個可能的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點。
　　 第二部分 S5a通過DR6誘導(dǎo)THP-1細胞分化的機制研究。
　　 在前期的研究中，檢測到了NF-κB信號通路經(jīng)典途徑中的蛋白磷酸化P65，在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化過程中的表達量升高。為了進一步深入研究NF-κB信號通路在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化過程中的作用，我們檢測了NF-κB非經(jīng)典通路中的蛋白P52的表達，同時檢測了下調(diào)

5、膜受體DR6后P-P65和P52的表達。為了研究NF-κB信號通路經(jīng)典和非經(jīng)典途徑在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化過程中的作用，我們使用了NF-κB抑制劑分別抑制了NF-1κB經(jīng)典和非經(jīng)典途徑，并通過細胞形態(tài)學(xué)和功能學(xué)觀察了S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化的情況。由此我們得到了NF-κB信號通路的激活在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化的過程中起到了重要的作用的結(jié)論。此外，我們還觀察了在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞分化過程中，在血液系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作

6、用的轉(zhuǎn)錄因子c-myb的變化。在給予THP-1 S5a誘導(dǎo)后，c-myb的mRNA水平明顯下調(diào)，而DR6 siRNA干擾可以抑制c-myb的下調(diào)。這些結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄因子c-myb也在S5a誘導(dǎo)THP-1細胞的過程中起到了關(guān)鍵的作用。
　　 本課題在實驗室前期的研究基礎(chǔ)上，確認了死亡受體6(DR6)可以和S5a功能性結(jié)合，并且介導(dǎo)了THP-1細胞的分化。定義了S5a為DR6的新配體。通過深入研究S5a誘導(dǎo)單核白血病細胞THP-1分化