豬MyoD-PPAr-γ2轉(zhuǎn)基因鼠外源基因的插入位點(diǎn)效應(yīng)的研究.pdf

1、外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)既受到表達(dá)載體的啟動(dòng)子影響，又受到外源基因在插入過程中所引起的插入位點(diǎn)效應(yīng)的影響。本實(shí)驗(yàn)室采用原核顯微注射法制備了可以穩(wěn)定遺傳的MyoD和PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠。為了研究影響外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的因素，本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室保留的F3代的MyoD和PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)世代純繁建系，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因在DNA、RNA和蛋白水平的表達(dá);通過熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR(TAIL-PCR)法對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠中的外源基因

2、MyoD和PPAR-γ2進(jìn)行定位，確定外源基因的插入位點(diǎn)，再分析外源基因整合過程中產(chǎn)生的插入位點(diǎn)效應(yīng)，為日后應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1、測(cè)定PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠和野生型鼠后腿肌肉組織中的甘油三酯含量和PPAR-γ蛋白的表達(dá)情況，檢測(cè)的結(jié)果表明PPAR-γ2陽性轉(zhuǎn)基因鼠肌內(nèi)甘油三酯的含量高于野生型鼠(p＜0.05)，PPAR-γ蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達(dá)高于野生型鼠;
　　2、用RT-qP

3、CR法檢測(cè)MyoD轉(zhuǎn)基因鼠各組織中外源基因的表達(dá)量，結(jié)果表明外源基因MyoD在肌肉組織中的表達(dá)量高于其他組織，且后腿肌肉組織中MyoD蛋白的表達(dá)量MyoD轉(zhuǎn)基因鼠明顯高于野生型鼠;
　　3、對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行純繁建系，經(jīng)過世代的純繁和檢測(cè)得到了純合陽性轉(zhuǎn)基因鼠;
　　4、采用熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠中的外源基因進(jìn)行定位，結(jié)果將PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠中的外源基因PPAR-γ2定位于鼠9號(hào)染色體的RP23-366E1，外

4、源基因PPAR-γ2存在串聯(lián)插入的情況;外源基因MyoD也存在串聯(lián)插入的情況;再通過ORF Finder對(duì)外源基因PPAR-γ2插入位點(diǎn)兩翼2000 bp的核酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)外源基因PPAR-γ2插入位點(diǎn)兩翼都有ORF框;又用Promoter2.0和Promoter Scan對(duì)外源基因PPAR-γ2插入位點(diǎn)上游2000 bp的核酸序列是否存在啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示外源基因PPAR-γ2插入位點(diǎn)的上游2000 bp內(nèi)存在內(nèi)源的啟

5、動(dòng)子;
　　5、采用絕對(duì)定量PCR法測(cè)定PPAR-γ2和MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)計(jì)算所得數(shù)據(jù)表明外源基因可以整合到轉(zhuǎn)基因鼠的基因組，且外源基因在轉(zhuǎn)基因鼠基因組上的拷貝數(shù)會(huì)因轉(zhuǎn)基因鼠的傳代而增長直至得到純合陽性轉(zhuǎn)基因鼠;
　　6、經(jīng)在線軟件預(yù)測(cè)外源基因的CpG島，結(jié)果表明構(gòu)建的外源基因PPAR-γ2的表達(dá)載體pGL3-Myoz1-PPAR-γ2his-Basic中沒有CpG島;構(gòu)建的外源基因MyoD的表達(dá)載體

6、pSV40-Myf6-MyoDEGFP-N1中存在3個(gè)CpG島且有一個(gè)處于表達(dá)載體的啟動(dòng)子區(qū)域。用亞硫酸鹽PCR-SSCP法分析MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因MyoD的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)MyoD陽性轉(zhuǎn)基因鼠中的外源基因MyoD的表達(dá)載體的Myf6啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島的甲基化的程度很高。
　　綜上所述，在PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠中，外源基因PPAR-γ2顯著高表達(dá);外源基因PPAR-γ2定位于9號(hào)染色體;外源基因PPAR-γ2的表達(dá)載體不存