轉(zhuǎn)基因油菜W-4高油酸性狀遺傳及T-DNA整合位點(diǎn)分析.pdf

1、油酸(18∶1)是最為重要的單不飽和脂肪酸，高油酸能降低血液中低密度脂蛋白膽固醇的含量，減緩動(dòng)脈粥樣硬化，有效預(yù)防冠心病等心血管疾病的發(fā)生;高油酸油還能有效甲酯化，有利于生物柴油生產(chǎn)，因此油酸含量的多少直接影響植物油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究材料是轉(zhuǎn)基因高油酸材料W-4，本文旨在研究ihpRNA誘導(dǎo)靶基因（fad2）沉默的效率及特異性、高油酸性狀遺傳和轉(zhuǎn)基因油菜T-DNA插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列克隆及應(yīng)用，主要結(jié)果如下:
　　 1.應(yīng)

2、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較了W-4與westar在種子發(fā)育過(guò)程中以及越冬期營(yíng)養(yǎng)器官中的fad2基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:(1) westar種子中fad2基因的相對(duì)表達(dá)量隨開(kāi)花后的天數(shù)呈逐漸增加的趨勢(shì);與westar相比，W-4種子中fad2基因的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花后第21、28天顯著下降，降幅達(dá)到60％左右。(2)W-4與westar植株越冬期根、莖、葉器官中fad2基因的相對(duì)表達(dá)量基本相同，無(wú)顯著差異。(3)W-4與westar脂

3、肪酸組成分析結(jié)果顯示:T4代種子中油酸含量(81.50±1.42％)較對(duì)照westar(70.89±2.20％)增加了近15％，多不飽和脂肪酸含量(W-4、westa的PUFA分別為5.25±0.54％、17.22±1.93％)下降了近70％;但根、莖、葉中的脂肪酸相對(duì)含量二者無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因油菜W-4中，表達(dá)的ihpRNA能有效地干擾靶基因的表達(dá)，并且此干擾具有種子特異性，而不干擾其它器官的fad2基因表達(dá)。
　

4、　 2.對(duì)油菜雜交組合W-4(P1)×westar(P2)的正交六世代(P1、P2、F1、B1、B2、F2)和反交六世代（P1、P2、RF1、RB1、RB2、 RF2）種子油酸含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明:(1)轉(zhuǎn)基因油菜高油酸品系W-4的T2、T3、T4、 T5世代的油酸含量分別為、84.983±0.57％、81.50±1.42％、85.1±0.73％，均在80％以上，說(shuō)明W-4種子油酸含量世代間穩(wěn)定，高油酸性狀能夠穩(wěn)定遺傳。(2)F1、

5、RF1油酸含量分別為77.55±1.30％、77.34±2.46％，偏向高油酸性狀，B1、RB1組合油酸含量分別為74.80±2.75％、76.1±4.80％，亦偏向于高油酸性狀，B2、RB2組合高油酸與低油酸1∶1分離;表明W-4高油酸性狀為顯性性狀，F(xiàn)2、 RF2群體高、低油酸呈3∶1分離，結(jié)果表明W-4高油酸性狀是一對(duì)顯性單基因控制的孟德?tīng)栠z傳，無(wú)細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)。(3)六世代Kan抗性鑒定結(jié)果與油酸性狀遺傳研究結(jié)果一致。
　

6、　 3.通過(guò)Tail-PCR方法獲得T-DNA插入位點(diǎn)旁側(cè)序列，對(duì)其序列進(jìn)行分析，并建立了轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法。結(jié)果如下:(1)左邊界旁側(cè)序列長(zhǎng)度為641bp，其中276 bp為載體序列，365 bp為油菜的基因組序列，其堿基組成GC含量為31.27％、AT含量為68.73％;右邊界旁側(cè)序列長(zhǎng)度為470bp，其中180bp為載體序列，290 bp為W-4的基因組序列，其堿基組成GC含量為32.6％、AT含量為67.4％。序

7、列分析顯示:整合到油菜基因組中的左邊界序列完整，僅有1個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換，由G轉(zhuǎn)換成了A;而右邊界區(qū)域則缺失包括RB border在內(nèi)的62個(gè)堿基，T-DNA整合特點(diǎn)為backbone-free整合，T-DNA整合區(qū)域?yàn)楦缓珹T區(qū)。(2)根據(jù)獲得的旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)序列特異性引物，建立了轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4轉(zhuǎn)基因事件的特異性檢測(cè)方法，依據(jù)此方法可以準(zhǔn)確的將轉(zhuǎn)基因油菜W-4與其他轉(zhuǎn)基因油菜品種區(qū)分開(kāi)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.05％。該事件特異性檢測(cè)方法