肝臟特異性F蛋白的克隆表達(dá)及其多抗制備.pdf

1、肝臟疾病嚴(yán)重影響人類健康，并對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生巨大影響。肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化等都是肝癌主要的致病原。因此肝病的診斷就成為醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的重要組成部分。人類肝臟F蛋白是一種新型的尚未應(yīng)用于臨床的直接反映肝損傷程度的生物學(xué)標(biāo)志之一。從80年代開始，人們開始研究血清F蛋白含量與肝損傷程度的關(guān)系，獲得了一些臨床數(shù)據(jù)。肝細(xì)胞中的F蛋白濃度與血清F蛋白的濃度之間存在的巨大差異以及F蛋白的嚴(yán)格的組織特異性，使

2、其成為一種非常有希望的反映肝細(xì)胞損傷程度的靈敏和特異的指標(biāo)。目前，肝臟特異性F蛋白的研究與臨床應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。 本文在前人研究的工作基礎(chǔ)上，從新鮮人肝臟組織提取肝臟總mRNA，確定其純度和完整性后對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)和PCR，擴(kuò)增出目的基因，然后將其與pUCm-T載體進(jìn)行連接獲得克隆質(zhì)粒pUCm-T-F并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中；將測序結(jié)果正確的克隆片斷與表達(dá)載體pET-15b連接，獲得F蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET1

3、5b-F并將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS中，用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，表達(dá)后通過親和層析柱(Ni<'2+>-charged IDA His-bind column)純化，用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳與免疫印跡(Western blot)對其進(jìn)行檢測。以此蛋白為抗原免疫兔子制備兔抗人F蛋白多克隆抗體，用間接ELISA法測定其抗體的效價(jià)，用免疫印跡檢測其特異性。 人F蛋白的基因克隆結(jié)果顯示目的基因大小為1200b

4、p左右，與預(yù)期值相符。表達(dá)后的全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，目的條帶分子量大小約為43kD，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。Western-blot顯示純化后的F蛋白與豚鼠抗人提純F蛋白多克隆抗血清反應(yīng)為陽性，說明我們經(jīng)基因工程方法得到的純化的F蛋白具有免疫活性。間接ELISA法測定抗體的效價(jià)，結(jié)果顯示其效價(jià)可達(dá)1:6400，可用于免疫反應(yīng)；Western-blot顯示制備的抗體與提純的人肝臟特異性F蛋白發(fā)生了反應(yīng)，表明我們制備的抗體具有免疫特

5、異性，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。 肝臟特異性F蛋白是反映肝損傷的一種靈敏、有效而又穩(wěn)定的指標(biāo)，同時(shí)F抗原在肝病早期診斷與治療、藥物的篩選與療效觀察、治愈狀況、肝損傷程度的判斷等方面以及法醫(yī)學(xué)方面、免疫耐受肝移植抗排斥方面的研究都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。用化學(xué)提純的方法很難得到大量F抗原，這就阻礙了其他研究的進(jìn)行。因此，本文采用基因工程方法得到人肝臟F抗原的基因克隆，并誘導(dǎo)表達(dá)人肝臟F蛋白，解決了其來源問題。同時(shí)以此基因工程蛋白為抗原制備