兔聲帶成纖維細胞的體外培養(yǎng)、示蹤與聲帶瘢痕的研究.pdf

1、正常聲帶組織因外傷或疾病損傷后所形成的纖維組織替代產(chǎn)物形成了聲帶瘢痕。由于瘢痕組織使聲帶變得堅硬，影響了聲帶固有層的粘彈性（viscoelastic strength），改變了聲帶的生物力學特性，從而減弱聲帶振動黏膜波的產(chǎn)生而影響發(fā)聲。目前，尚未找到一種理想的預防和治療聲帶瘢痕的方法。近年來，組織工程學技術(shù)在組織器官重建方面取得了令人矚目的進展，其主要原理是以少量種子細胞經(jīng)體外擴增后與生物材料、細胞因子結(jié)合，修復較大的組織或器官缺損，重

2、建組織器官的生理功能，最終達到完美的形態(tài)甚至功能修復的目的。將組織工程學的技術(shù)方法應用于喉科，有望在未來實現(xiàn)聲帶，甚至喉的再生。人類的聲帶組織是一個高度分化的分層結(jié)構(gòu)，從組織學結(jié)構(gòu)上可分上皮層、固有層和肌肉層（甲杓肌）。聲帶固有層又分為固有淺層（Reinke’s層），固有中層和固有深層。這種分層在描述聲帶結(jié)構(gòu)功能方面具有重要意義。固有層是聲帶最重要的特征性結(jié)構(gòu)，主要包括細胞及細胞外基質(zhì)成分。組成固有層的細胞為數(shù)較少，主要細胞有：成纖維細

3、胞，肌成纖維細胞和巨噬細胞。成纖維細胞是維持固有層結(jié)構(gòu)與功能的重要細胞，主要分布在固有層深層，其調(diào)控細胞間質(zhì)的沉著、降解及重新分布；細胞外基質(zhì)成分包括纖維蛋白和間隙蛋白。
　　 本研究第一部分我們首先制作了兔聲帶瘢痕模型，并對聲帶瘢痕進行初步研究。在支撐喉鏡下，用喉鉗夾取雙側(cè)聲帶前中部組織（未達肌層），未手術(shù)者作為正常對照，1個月后處死動物，收獲聲帶組織，采用Masson三色染色觀察聲帶膠原，采用經(jīng)過透明質(zhì)酸酶處理的Alcian

4、 blue染色觀察透明質(zhì)酸。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進行對切片染色進行半定量分析，實驗結(jié)果表明瘢痕聲帶的膠原成分明顯增多，透明質(zhì)酸含量無明顯改變。
　　 本研究中，我們對聲帶固有層的組織工程學再生進行了初步探索。組織工程學的三個要素是種子細胞，支架材料，和細胞因子。本研究第二二部分首先進行了種子細胞-兔聲帶成纖維細胞（vocal fold fibroblasts，VFFs）的體外培養(yǎng)。取兔聲帶組織，消化法獲取

5、成纖維細胞，用含有胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，摸索出最佳培養(yǎng)條件。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及生長狀況，并經(jīng)過傳代使細胞純化。利用免疫組化方法，檢測成纖維細胞的特異性蛋白Vimentin，結(jié)果Vimentin陽性率90％以上，證明所培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞，且陽性率較高。
　　 本研究第三部分觀察培養(yǎng)的細胞在異體生物體內(nèi)相容性及生長情況。我們對培養(yǎng)的細胞進行Ad-EGFP標記。取新西蘭兔6只，隨機選取2只兔作為無干

6、預組，4只新西蘭兔做雙側(cè)聲帶急性損傷模型，左側(cè)聲帶損傷部位注射104個/ml濃度的Ad-EGFP標記的細胞混懸液，向右側(cè)聲帶損傷部位注入生理鹽水1ml作為對照。聲帶注射細胞后，兔生長情況良好，均未發(fā)生感染、喉水腫，免疫排斥等反應。15天后收獲聲帶組織，熒光顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)成活的VFFs。說明單純VFFs注射到異體組織很難存活，為其在動物體內(nèi)生長提供生長支架可能會利于生長。
　　 總之，本研究對聲帶組織工程學進行了初步探索，制備