AFDX-116對(duì)體外培養(yǎng)人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞調(diào)控的研究.pdf

1、近視是一種最常見(jiàn)的世界性眼科疾病，在歐美，大約有三分之一的美國(guó)成年人患有不同程度的近視[1]，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，在一些亞洲國(guó)家，近視的患病率逐漸增高且近年來(lái)有逐漸超過(guò)歐美西方國(guó)家的趨勢(shì)[2]。作為結(jié)締組織，鞏膜由成纖維細(xì)胞以及膠原蛋白組成，鞏膜成纖維細(xì)胞及膠原成分在眼球正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及近視發(fā)生過(guò)程鞏膜重塑中發(fā)揮極其重要的作用。鞏膜成纖維細(xì)胞參與鞏膜重塑過(guò)程，在鞏膜組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性方面起到重要作用，當(dāng)發(fā)生近視后，患者鞏膜成纖維細(xì)胞減

2、少，膠原纖維變細(xì)，鞏膜變薄。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，在近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，成纖維細(xì)胞中膠原蛋白水平的變化對(duì)鞏膜重塑起著重要作用[3-5]。由此，對(duì)鞏膜成纖維細(xì)胞數(shù)量及膠原蛋白含量在近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化加以研究，從而進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新型藥物以抑制近視發(fā)展對(duì)于近視的治療意義重大。
　　在近視患者中，為了有效抑制近視的發(fā)展，經(jīng)過(guò)較大量的臨床觀察以及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，選擇性M1受體拮抗劑哌侖西平和非選擇性M受體拮抗劑阿托品在抑制近視發(fā)生發(fā)展方面療效

3、確切并在臨床中得到廣泛的應(yīng)用[6]。M1-M5五種M受體亞型在鼠、人眼鞏膜組織中均有表達(dá)[7]，抑制近視藥物不僅僅局限于非選擇M受體拮抗劑及M1受體拮抗劑，除了阿托品和哌侖西平外，選擇性M4受體拮抗劑也可作用于鞏膜成纖維細(xì)胞和鞏膜膠原蛋白從而延緩近視發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，M2受體在近視過(guò)程中也可起到相應(yīng)的作用[14]。此次實(shí)驗(yàn)選取人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞，對(duì)該細(xì)胞中M2受體是否表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)觀察經(jīng)選擇性M2受體拮抗劑AFDX-116

4、作用于細(xì)胞后，M2受體的表達(dá)量、細(xì)胞增殖的數(shù)量以及I型膠原合成量所發(fā)生的變化。探討人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞M2受體在近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用以及其選擇性拮抗劑AFDX-116在近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用和作用機(jī)制。
　　目的：
　　檢測(cè)人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞(humanfetalscleralfibroblasts，HFSFs)中毒蕈堿乙酰膽堿能M2受體的表達(dá)，觀察經(jīng)AFDX-116藥物刺激后，M2受體在細(xì)胞的表達(dá)量、鞏

5、膜細(xì)胞數(shù)量以及I型膠原蛋白合成量的變化，探討AFDX-116在近視過(guò)程當(dāng)中所起的作用及作用機(jī)制。
　　方法：
　　取5-7代HFSFs，分為兩組，實(shí)驗(yàn)組:接受AFDX-116刺激，培養(yǎng)液中藥物終濃度分別為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L，對(duì)照組:不接受藥物刺激，僅加入等體積的培養(yǎng)液。M2受體mRNA在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量由逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReversTranscription-P

6、olymeraseChainReaction，RT-PCR)法進(jìn)行檢測(cè);CCK8(CellCountingKit-8)法檢測(cè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組HFSFs增殖變化情況，于酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)吸光值(OD值);免疫熒光(Immunofluorescence，IF)法對(duì)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組HFSFsI型膠原蛋白(COL1A1)在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　　1.M2受體mRNA在HFSFs的表達(dá)及變化
　　對(duì)照組HFSFs可

7、檢測(cè)到M2受體mRNA的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量為0.372±0.022，實(shí)驗(yàn)組HFSFs在AFDX-1161μmol/L(0.418±0.007)、10μmol/L(0.579±0.035)、100μmol/L(0.768±0.042)濃度下，其M2受體mRNA相對(duì)表達(dá)量有所增高，與對(duì)照組相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029、0.001、0.000);在AFDX-1160.1μmol/L(0.391±0.018)濃度下M2受體mRNA相對(duì)

8、表達(dá)量未觀察到明顯變化，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.327)。
　　2.HFSFs增殖變化
　　對(duì)照組HFSFsOD值為0.820±0.048，實(shí)驗(yàn)組HFSFs在AFDX-1161μmol/L（0.725±0.078）、10μmol/L（0.690±0.053）、100μmol/L（0.612±0.042）濃度下OD值均有不同程度的降低，差異較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049、0.004、0.000);在AFD

9、X-1160.1μmol/L(0.802±0.078)濃度下OD值僅輕度下降，較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.745)。
　　3.COL1A1表達(dá)變化
　　IF結(jié)果顯示AFDX-116可促進(jìn)HFSFsCOL1A1分泌，對(duì)照組HFSFs可檢測(cè)到COL1A1表達(dá),實(shí)驗(yàn)組HFSFs在AFDX-1160.1μmol/L濃度下未觀察到明顯的COL1A1分泌增多，在AFDX-1161μmol/L、10μmol/L、100μmol/L濃