基于2b-RAD技術(shù)的家蠶BmNPV抗性遺傳的研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目模式昆蟲，也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，蠶絲具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是很多地區(qū)農(nóng)民的主要收入來(lái)源。但是，家蠶病害的發(fā)生也給桑蠶業(yè)帶來(lái)了極大困擾，嚴(yán)重制約了蠶桑產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最大的疾病，其中家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）引起的血液型膿病危害最大，約占蠶病損失的70％，該病目前尚無(wú)法治療。因此從生產(chǎn)和安全方面來(lái)講，家蠶核型多角體病毒抗性基因

2、的尋找和抗性品種的培育都是一項(xiàng)重要工作。
　　本課題采用抗BmNPV蠶品種華康2號(hào)一代雜交種來(lái)源的抗性品系A(chǔ)N、抗BmNPV蠶品種野三元N中的抗性親本野BN和易感性品系C108作為研究材料，在明確供試蠶品種對(duì) BmNPV抵抗力的基礎(chǔ)上，構(gòu)建抗性遺傳分離群體，利用2b-RAD分析技術(shù)，探索AN、野BN品種的BmNPV抗性遺傳機(jī)制，主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.家蠶AN、野BN與C108品系的BmNPV抗性鑒定
　　抗

3、性品系 AN在2齡起蠶 BmNPV多角體添食的半數(shù)致死濃度（LC50）為2.154×109個(gè)/mL、半數(shù)致死劑量（LD50）為1.436×107個(gè)/頭蠶。野 BN在添食BmNPV病毒多角體濃度達(dá)到1×108/mL時(shí)才發(fā)生蠶體死亡，野BN的LD50為2.5×107個(gè)/頭蠶。感性品種 C108接種病毒后發(fā)病率很高，當(dāng)多角體濃度達(dá)到1×107時(shí)全部死亡，半數(shù)致死濃度（LC50）低至1.239×105個(gè)/mL，LD50為8.266×102個(gè)/頭

4、蠶?？剐云废礎(chǔ)N及野BN與感性品系C108間的LD50差距都達(dá)到104以上。因此，采用BmNPV多角體懸液濃度為1×108個(gè)/mL浸漬桑葉對(duì)2齡蠶進(jìn)行添毒12h，可以有效篩選出AN和野BN品系來(lái)源的BmNPV抗性基因攜帶個(gè)體。
　　2.家蠶AN品系與野BN品系BmNPV抗性基因的2b-RAD分析
　　1）2b-RAD標(biāo)記的分析
　　為了解析家蠶AN、野BN品種對(duì)BmNPV抗性的遺傳機(jī)制，用易感品種C108作為回交親本分

5、別構(gòu)建兩品種的BC4M[C108×((((AN×C108)×C108)×C108)×C108)]和BC3M[C108×(((野BN×C108)×C108)×C108)]遺傳分離群體。對(duì)2個(gè)遺傳分離群體通過(guò)2齡期起蠶進(jìn)行1×108個(gè)/mL NPV多角體懸液浸漬桑葉添毒12h，常規(guī)飼養(yǎng)7d后存活個(gè)體作為抗性分離群體。對(duì)3個(gè)親本和2個(gè)抗性分離群體的基因組DNA構(gòu)建2b-RAD文庫(kù)并進(jìn)行Illumina測(cè)序。獲得可區(qū)分AN品系與C108品系間差

6、異的多態(tài)性SNP標(biāo)記有11919個(gè)，；獲得可區(qū)分野BN與C108品系間差異的多態(tài)性SNP標(biāo)記12293個(gè)。SNP分子標(biāo)記主要分布于內(nèi)含子（44.13%）、基因間（21.92%）、基因下游（12.12%）和上游（11.09%）及外顯子（8.82%）區(qū)域，基因編碼區(qū)內(nèi)的SNP同義突變、錯(cuò)義突變和無(wú)義突變的比例分別為82.03%、17.70%和0.27%。子代1與子代2之間的結(jié)果無(wú)明顯差異。
　　2）AN和野BN品系抗性來(lái)源在染色體的分

7、布與抗病貢獻(xiàn)率的分析
　　采用下列公式計(jì)算代表每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)相應(yīng)的BmNPV抗性關(guān)聯(lián)度的SNP-index：SNP-index=抗性品系類型SNP檢出頻次/（感性品系類型SNP檢出頻次+抗性品系類型SNP檢出頻次）。對(duì)基因組序列以500Kb劃窗、5Kb步移計(jì)算SNP-index平均值折線圖，以每個(gè)染色體的折線與橫坐標(biāo)之間的面積代表各染色體對(duì)BmNPV抗性的貢獻(xiàn)，各染色體SNP-index折線面積占全基因組SNP-index折線總面

8、積的百分率作為各染色體的抗性貢獻(xiàn)率?？剐苑蛛x群體全基因組BmNPV抗性關(guān)聯(lián)的SNP-index分析表明，AN、野BN品種的BmNPV抗性相關(guān)標(biāo)記位于多個(gè)染色體上，AN品系抗性貢獻(xiàn)率前5位的是第5、10、27、23和4號(hào)染色體，野BN品種抗性貢獻(xiàn)率前5位的是第4、27、15、18和6號(hào)染色體。多個(gè)SNP-index高值位點(diǎn)與已報(bào)道的BmNPV抗性相關(guān)基因的位置具有較高的對(duì)應(yīng)性。推測(cè)AN、野BN品系BmNPV高抗性與抗性主基因及其他抗性基因

9、的聯(lián)合作用有關(guān)。
　　3.家蠶AN品系與野BN品系BmNPV抗性差異的初步分析
　　1）基于各染色體貢獻(xiàn)率的差異分析
　　家蠶AN品系與野BN品系的BmNPV抗性與27號(hào)染色體連鎖，并且在兩個(gè)品系的抗BmNPV的貢獻(xiàn)率中分別位于第3和第2位，這是屬于兩個(gè)品種的共性。3號(hào)染色體、7號(hào)染色體、8號(hào)染色體在兩個(gè)品系貢獻(xiàn)率的對(duì)比中差異較大，家蠶AN和野BN品系中，Chr3的貢獻(xiàn)率分別為4.84%和2.29%、貢獻(xiàn)率排序分別為第

10、9位和第22位；Chr7的貢獻(xiàn)率分別是4.16%和1.44%，排序分別為第11位和第28位）；Chr8的貢獻(xiàn)率分別為1.06%和4.53%，排序分別為第26位和第9位。表明家蠶AN與野BN可能具有較大的遺傳血緣和抗性來(lái)源機(jī)制。
　　2）基于高值SNP-index的標(biāo)記個(gè)數(shù)的差異分析
　　在兩個(gè)品種的對(duì)比分析中，以SNP-index為0.5?0.2的多態(tài)性SNP標(biāo)記定義為NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記，各染色體NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記差

11、異個(gè)數(shù)占全基因組NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記差異總數(shù)的比例為依據(jù)進(jìn)行分析，得出Chr27、Chr03、Chr12、Chr16、Chr23、Chr25依次位于前6位，這6條染色體的NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記的差異總比例達(dá)到54.82%，說(shuō)明第27、3、12、16、23、25這6個(gè)染色體在AN、野BN的BmNPV抗性方面占有重要地位，并且在這些染色體中存在兩個(gè)品種間抗性能力不同的抗性基因或過(guò)程。在這些染色體中的scaffold水平上分析發(fā)現(xiàn)：Bm_s