家蠶核型多角體病毒(BmNPV)增殖復制關鍵基因的篩選與鑒定.pdf

1、家蠶作為具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目模式昆蟲，在世界的文化傳播、經(jīng)濟和社會的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而每年因蠶病引起的損失占蠶業(yè)總生產(chǎn)的比例高達25％。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus，BmNPV）是蠶業(yè)上危害最嚴重且最常見的一類病原微生物。隨著1999年對BmNPV全基因組序列測定的完成，BmNPV的侵染增殖分子機制的研究逐漸深入。本研究利用家蠶內源性的microRNA骨架，采用RNA

2、i技術，篩選及鑒定BmNPV增殖復制的關鍵基因。主要研究結果如下:
　　1.BmNPV增殖復制相關基因的篩選與克隆
　　根據(jù)文獻報道的桿狀病毒基因功能分析，初步篩選與BmNPV增殖復制相關的34個基因進行克隆。其中參與病毒DNA復制的基因有9個，參與病毒BV產(chǎn)生的基因有28個，與核衣殼產(chǎn)生相關的基因有12個，影響晚期基因表達的基因有8個，影響極晚期基因表達的基因有7個。
　　2.BmNPV增殖復制關鍵基因的鑒定

3、　　從已初步篩選的34個基因中最終篩選8個候選基因作為后續(xù)實驗的研究對象。這8個基因分別是:dbp、lef2、lef3、lef7、lef10、lef11、p143、vp1054。分別構建這8個基因對應的干涉載體和熒光素酶載體，轉染BmN-SWU1細胞。轉染細胞48h后測酶活，發(fā)現(xiàn)lef2和lef11的抑制效果達到90％以上，dbp、lef3、p143、vp1054抑制效果達到80％以上，而lef10抑制效果只有12.4％，lef7沒有抑

4、制效果。在病毒的感染率統(tǒng)計實驗中，pIZ-DsRed-milefl1轉染的細胞中病毒的感染率僅為9.16％，pIZ-DsRed-milef10病毒感染率為26.2％，pIZ-DsRed-midbp、pIZ-DsRed-milef3病毒感染率分別為58.4％和54.6％，pIZ-DsRed-mip143和pIZ-DsRed-mivp1054病毒感染率分別是71.1％和67.3％，而pIZ-DsRed-milef2，pIZ-DsRed-mi

5、lef7感染率達到了100％。以上結果表明在本研究所篩選的8個候選基因，lef11是BmNPV增殖復制的關鍵基因。
　　3.不同啟動子驅動的同一干涉載體對病毒增殖復制的影響
　　將篩選的7個活性不同的啟動子A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70分別替換pIZ-DsRed-milef11中的IE2啟動子，并將構建的干涉載體轉染BmN-SWU1細胞，轉染細胞48h后測酶活。A4、IE1、IE

6、1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉載體對lef11基因的抑制效果分別是92.6％、97.9％、96.9％、94.8％、95.3％、96.8％、97.9％。在病毒的感染率統(tǒng)計實驗中，A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉載體轉染的細胞中，病毒的感染率分別是18.1％、8.34％、8.41％、11.1％、11.9％、12.1％和11.8％。干涉效果以及對病毒增殖復制的影響