家蠶馬氏管響應BmNPV感染相關miRNA的初步研究.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目模式昆蟲,其免疫防御機制是研究熱點。昆蟲馬氏管是一種自主免疫組織,能夠完全不依賴于脂肪體而啟動有效免疫應答。本課題組已在蛋白質水平上初步證實家蠶馬氏管具有免疫調控功能。近年研究表明miRNA在生物體抗病毒感染方面發(fā)揮重要作用。本文對家蠶馬氏管響應BmNPV病毒感染后在miRNA水平上進行探索研究,獲得以下初步結果。
　　一、家蠶馬氏管組織小RNA文庫的構建與深度測序
　　家蠶五齡起蠶感染BmNPV-EGFP,

2、注射TC-100為對照,在感染后3h、6h、12h和24h時相收集馬氏管組織,構建了CK和NPV兩個小RNA文庫,通過IlluminaSolexa高通量測序平臺進行深度測序。CK文庫和NPV文庫中測得原始小RNA序列分別為16681601條和16509994條。經過生物信息學分析,CK文庫和NPV文庫中有效數據留存率較高(平均為76.5％),有效數據長度主要分布在22bp左右,為Dicer酶剪切合成miRNA主要長度分布范圍,可供進一步

3、數據分析。序列與Genbank數據庫比對,去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段,合并處理后,兩個樣本共檢測到已知miRNA313個(其中254個為共有);DEGseq分析結果顯示兩者差異表達的miRNA為53個;根據家蠶基因組序列預測獲得新miRNA108個。根據CK和NPV兩個文庫中miRNA測序拷貝數差異,共篩選出候選miRNA中28個,其中17個已知miRNA和11個新miRNA。
　　二、家蠶馬氏管響

4、應BmNPV感染候選miRNA的實驗驗證
　　通過莖環(huán)RT-PCR方法對上述28個候選miRNA進行了實驗驗證,經測序鑒定正確的有11個miRNA,其中4個已知miRNA(bmo_miR_375、bmo_miR_2731、bmo_miR_927、bmo_miR_7)和7個新miRNA(miR_N11、miR_N13、miR_N33、miR_N49、miR_N74、miR_N80、miR_N89)。采用RT-PCR方法對11個候選m

5、iRNA進行了家蠶馬氏管對照組與病毒感染組混合樣品中相對表達分析,結果顯示,bmo-miR_375在感染病毒組樣品池中表達顯著高于對照組,miRN49和miRN74在對照組樣品池中表達顯著高于病毒感染組,而其他miRNA在對照組和感染組中相對表達量無明顯差異。我們從中篩選出候選bmo-miR_375做進一步表達分析與靶標預測。
　　三、家蠶編碼的bmo-miR_375的表達分析及其靶標預測
　　家蠶五齡起蠶感染BmNPV-E

6、GFP,注射TC-100為對照,在感染后3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h時相收集馬氏管組織,對bmo-miR_375在不同時相表達進行半定量分析,結果顯示bmo-miR_375在對照組和病毒組中各時相均有表達。除了48h時相外,其他時相病毒感染組中bmo-miR_375的相對表達均高于對照組中各時相。尤其是在12h、24h和96h這3個時相中,bmo-miR_375在病毒感染組相對表達量顯著高于對照組。在病毒

7、感染后3h、6h和12h和24h之間,bmo-miR_375的相對表達水平整體上呈逐漸上升趨勢,然后在48h、72h呈現下降趨勢,在96h、120h時,又呈先升高后下降趨勢。bmo-miR_375在病毒感染組中12h、24h和96h升高趨勢原因,推測可能是家蠶通過編碼自身bmo-miR_375來調控BmNPV在馬氏管內復制進程相關基因的表達,以便達到宿主抵抗病毒感染的免疫防御效應。而bmo-miR_375在48h、72h和120h呈現的

8、下調趨勢,可能與BmNPV以自己的某種方式調控宿主miRNA的合成,從而抑制bmo-miR_375的表達,來破壞由宿主miRNA介導的宿主防御系統相關。在48h時相中,bmo-miR_375在對照組中相對表達水平較其他時相中略高,這是一個有趣的發(fā)現,該現象原因需要進一步實驗驗證。
　　利用生物信息學軟件PITA、RNAhybrid和RNA22,對bmo-miR_375在家蠶和病毒基因組中靶標預測。bmo-miR_375在家蠶宿主內

9、的可能的靶標為表皮蛋白、超氣門蛋白、家蠶myb轉錄因子和30K脂蛋白前體,而其在病毒BmNPV中可能靶標有病毒轉錄調控因子p47、桿狀病毒Y142蛋白和幾丁質結合域2型。其中p47為病毒轉錄調控因子,為RNA聚合酶亞基,參與病毒的復制過程,推測家蠶宿主馬氏管組織可能通過編碼的bmo-miR_375來直接或間接抑制病毒復制過程,從而達到響應病毒感染的免疫效應。
　　我們對bmo-miR_375在表皮、中腸、脂肪體、后部絲腺、氣管、精

10、巢、血淋巴、馬氏管等組織中的表達譜分析,結果顯示,bmo-miR_375在對照組中腸和血淋巴中無表達,而在其他組織均有表達,尤其是在后部絲腺中,bmo-miR_375的相對表達水平顯著高于其他組織。而該miRNA在病毒感染組的所有組織中均有表達,無論在對照組還是感染病毒組中,bmo_miR_375在家蠶后部絲腺組織中表達量都顯著高于其他組織中的表達。相比于對照組中組織,bmo-miR_375在病毒感染組后部絲腺內表達量更高,其次是馬氏管