rhOP-1工程菌的發(fā)酵及其產(chǎn)物的純化、復(fù)性與活性檢測(cè).pdf

1、研究目的： 本實(shí)驗(yàn)在先前已有的研究基礎(chǔ)上，通過對(duì)表達(dá)rhOP-1工程菌的發(fā)酵條件的優(yōu)化，擬建立一種穩(wěn)定、高效的發(fā)酵工藝。為獲得高純度、有活性的目的蛋白，在對(duì)rhOP-1純化后進(jìn)一步比較影響rhOP-1復(fù)性的因素，確定最佳復(fù)性條件，并初步探索疏水色譜法一步純化和復(fù)性，提高復(fù)性效率。同時(shí)采用體外、體內(nèi)兩種方法測(cè)定大腸桿菌表達(dá)的rhOP-1生物學(xué)活性，擬建立rhOP-1活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)并為其質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究

2、方法： 1.對(duì)表達(dá)rhOP-1的工程菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，摸索不同菌種、培養(yǎng)基、pH值、接種量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間等對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響。放大至發(fā)酵罐30℃培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使培養(yǎng)基溶氧保持在20％以上，利用2mol/LNaOH和1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值，補(bǔ)充氮源和碳源，待菌液OD600在1.2～1.5范圍內(nèi)時(shí)，迅速升溫誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4h后，收集菌體。Westernblot鑒定目的蛋白rhOP-1,并比較不同發(fā)酵批次的重

3、復(fù)性，檢測(cè)多次傳代后的工程菌的穩(wěn)定性。 2.超聲裂解收集的菌體，經(jīng)多次洗滌后收集包涵體，用高濃度的變性劑溶解包涵體。利用離子交換法和疏水色譜等方法對(duì)rhOP-1進(jìn)行層析純化，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；通過改變溫度、pH值以及添加一些促復(fù)性劑對(duì)rhOP-1進(jìn)行復(fù)性，Totallab軟件分析分析蛋白純度和二聚體含量。通過對(duì)包涵體蛋白先透析復(fù)性，在低濃度變性劑的條件下純化目的蛋白，并嘗試疏水色譜法對(duì)rhOP-1復(fù)性，以提高復(fù)行效率。

4、 3.比較rhOP-1對(duì)不同細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，篩選一種敏感的細(xì)胞株作為體外活性測(cè)定的效應(yīng)細(xì)胞，采用改良MTT、PNPP和RT-PCR等方法檢測(cè)rhOP-1對(duì)效應(yīng)細(xì)胞增殖、ALP活性和基因表達(dá)的影響，同時(shí)通過小鼠肌袋埋植實(shí)驗(yàn)觀察植入rhOP-1埋植劑后的組織病理切片和鈣含量的變化，檢測(cè)其體內(nèi)活性。 研究結(jié)果： 1.表達(dá)rhOP-1的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后OD600nm達(dá)10.0左右，每升培養(yǎng)液可獲得20g左右菌體，目的蛋

5、白表達(dá)量占菌體蛋白的30％以上。多次傳代后經(jīng)SDS-PAGE、酶切鑒定、測(cè)序分析表明工程菌菌種遺傳穩(wěn)定，Westernblot鑒定表明所表達(dá)的外源蛋白即為目的蛋白rhOP-1。 2.經(jīng)過包涵體洗滌和純化后rhOP-1純度可達(dá)98％以上。確定了在低溫(4℃)、pH9.0條件下并添加0.2mol/LL-Arg和3mmol/LGSH、0.3mmol/LGSSG的復(fù)合復(fù)性緩沖液對(duì)rhOP-1復(fù)性效果較好。疏水復(fù)性獲得的rhOP-1二聚體

6、含量在50％左右，但有部分蛋白沉淀在介質(zhì)上，需要進(jìn)一步改進(jìn)條件。 3.NIH3T3細(xì)胞可作為rhOP-1體外測(cè)活的靶細(xì)胞，體外活性測(cè)定結(jié)果顯示rhOP-1在一定濃度范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖數(shù)、堿性磷酸酶水平和骨鈣素mRNA表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組。在體內(nèi)rhOP-1埋植劑植入小鼠肌間隙兩周后，與對(duì)照組相比可以提高鈣含量，并且有明顯的成骨趨勢(shì)。 結(jié)論： 建立了穩(wěn)定、高效的工程菌的發(fā)酵工藝，rhOP-1經(jīng)過純化、復(fù)性