畢赤酵母植酸酶工程菌的改造及其初步發(fā)酵工藝研究.pdf

1、睪十巖耄夫學研究生學位論文論文陬目望壺醒堡墮酸酶王焦重盟墮童研究q ：姓 名陳杏洲及其口，步發(fā)酵工藝研究々 業(yè)：微生物學l I I 竹學位絨 刖碩士導師姓名：粱運樣副教授目淳泰副教授研究方向醇工程淪義撤告 提交日期2 0 0 4 年6 月中國 武漢坐主壘些查蘭! ! 竺曼堡圭堡奎——一 A b s t r a c tP h y t a s ea r e e n z y m e st h a t c a t a l y z e t h e

2、 h y d r o l y s i so fp h y t a t e i n t o m y o —i n o s i t o l a n di n o r g a n i cp h o s p h a t e ．M o n o g a s t r i ca n i m a l s l i k ep i ga n d p o u l t r y , f o rt h el a c ko f p h y t a s ei nt h e

3、a l i m e n t a r yt r a c t ．C O u l d n ’ta s s i m i l a t ep h y t a t et h a t 曲o u n d e di nf e e d ．T h ep r o b l e mc o u l db es o l v e d b y a d d e dp h y t a s e i n t o l i v e s t o c k f o o d ．I n a d

4、d i t i o n ．p h y t a t e c a l l a l S O a c t a s a Ⅱa n t i —n u t r i e n tf a c t o ri na n i t a a lf e e e l ，i tW O u l d a l S Oi n c r e a s et h ef e e dv a l u eb y r e r n o v h a gt h i sa n t i ．n u t r i

5、 e n tf a c t o r ．H o w e v e r , d u e t ot h eh i i 曲c o s ta n d 也e w e a k t h e r m o s t a b i l i t y o f Ⅱl ep h y t a s Cp r o d u c t s ，O n l Y a l i m i t e da m o u r o f c o m m e r c i a lm i c m b i a lp

6、 h y t a s e sa r eu s e di nf e e d s t u f f ．T h u se c o n o m i c a l a n d t h e r m o s t a b l e p h y t a s e s a r c b a d l y r e q u i r e d i nt h e f c c d s t u f f i n d u s t r y ．I n t h i ss t u d y ，t

7、 h r e e p a i l s o f p r i m e r s h a d b e e n d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d ．n 圯U U G l e o t i d es e q u e n c e o f G A P 、S S a n d 蘆向以h a d b e e n a m p l i f i e d r e s p e c t i v e l y f r o

8、m t e m p l a t e D N A a sf o U o w ：t o t a l D N A o f P i c h 船p a s t o r i s G S l l 5 、p P I C 9 K a n d p P I C 9 K - p h y A b v P C R m e t h o d ，t h e l l f u s i n gf r a g m e n tF o s v h a d b e e n a m p

9、 l i f i c a t e db y f u s i n gP C R t ol i n k G A P 、S S a n d p h y A t o g e t h e r ，A f t e rd i g e s t e d w i t h A a t I I a n d E ∞RI 。F G S Va n d p A 0 8 1 5 h a d b e e n l i n k e d t o g e t h e r a n d

10、t r a n s f o r m e d i n t o E c o l iD H 5 0 c ，t h e nS O m et r a n s f o r m a n t so w n e dr e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d p A O G S P b a d b e e n s e l e c t e d ，T ov e i l f yt h el i n

11、k a g eo f F G s Pa n dp A 0 8 15 ，p A O G S P W a s d i g e s t e db ye n z y m e s A a t I Ia n dE c o R Ia n da n a l y s i z e db ye l e c t r o p h e r o s i s ．T h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o

12、 rp A O G S Pw a sc l e c t r o p o r a t e di n t o t h eh o s tc e l l P i c h i ap a ，t o r i sG S l 15 ．i nw h i c ht h ep l a s m i dw o u l di n t e g r a t ei n t ot h eg e n o m e b y t h ec r o s s o v e r e v e

13、 n to f h o m o l o g i c a lD N A f r a g m e n t s ．A s l o n ga si tO C C l l F S ，t h ec o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no f p h y t a s eg e n ei nP i c h i a p a s t o r i sG S l l 5i sa v a l i b l e ．T k

14、r e s u l tC O u l db ed e t e c t e db yP C R ．T h ei n t e m tc l o n e sw o u l dc o m e o u tw i t ha h y d r o l y t i cc k c l e o n a s e l e c t i v e s o l i d m e d i t m a c o n t a i n e d c a l c i u m p h y

15、 t a t e ．T r a n s f o r m a n t s w e r e a p p l i e d i n t of e r m e n t a t i o n t e s t s ．A f t e r9 6 h l i q m d c u l t i v a t i o ni nf l a s k ，t h e p h y t a s e a c t i v i t yw a n 1 3 9 7 u ／m 1 ．K e