胰島素抵抗下肝X受體對(duì)肝糖代謝的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 LXR活化后對(duì)胰島素抵抗下肝糖代謝的影響
　　研究目的:觀察胰島素抵抗下LXR活化后對(duì)糖代謝的改善作用和對(duì)成脂的影響。
　　材料和方法:(1)選用雄性db/db和C57BL/6小鼠作為研究對(duì)象，隨機(jī)分為db/db對(duì)照組(db/db Con)和db/db TO901317組(db/db TO); C57 Con組和C57 TO組。每組入組9只。db/db和C57 Con組每日腹腔注射DMSO(10％DMSO250ul

2、)，db/db和C57 TO組每日腹腔注射LXR激動(dòng)劑TO901317(30mg/Kg)，一共用藥14天。小鼠用藥前測(cè)定體重、空腹血糖和腹腔胰島素耐量試驗(yàn)，用藥后測(cè)定體重、空腹血糖、空腹胰島素和游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）及行腹腔胰島素耐量試驗(yàn)。小鼠處死后選取肝臟作為研究器官，肝臟組織學(xué)檢查觀察肝細(xì)胞脂肪變性情況。實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)的方法測(cè)定各組小鼠肝內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(P

3、EPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-pase）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c) mRNA的表達(dá)改變情況。(2)選取HepG2細(xì)胞，應(yīng)用棕櫚酸(Palmitate，PA)誘導(dǎo)，通過(guò)免疫印跡法評(píng)估蛋白激酶B(Akt)蛋白磷酸化水平的變化，建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型。應(yīng)用Real-Time PCR的方法觀察TO901317對(duì)細(xì)胞內(nèi)PEPCK、G-6-pase和SREBP-1c mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)與C

4、57小鼠比較，db/db小鼠具有體重、血糖、胰島素、FFA和HOMA-IR顯著增高的特性，P＜0.05。與db/db Con組相比，db/db TO組的血糖下降，空腹胰島素水平降低，胰島素敏感性顯著改善，P＜0.05，血清游離脂肪酸沒(méi)有改變。與C57 Con組相比，C57 TO組體重、血糖、胰島素、FFA和HOMA-1R無(wú)明顯改變。肝臟組織學(xué)結(jié)果顯示，與C57小鼠相比，db/db小鼠具有明顯的肝臟脂肪浸潤(rùn)病理改變，在應(yīng)用TO901317

5、后，病變略有加重。C57小鼠用藥后肝臟組織學(xué)檢查無(wú)明顯變化。Real-Time結(jié)果顯示，與db/db Con組相比，db/db TO組小鼠PEPCK和G-6-pase mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，P＜0.05，而C57 TO與C57 Con組相比，PEPCK和G-6-pase mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變。與db/db Con和C57 Con組相比db/db TO和C57 TO組小鼠SREBP-1c mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)。(2) HepG2誘導(dǎo)

6、成模后，出現(xiàn)Akt蛋白磷酸化水平降低，PEPCK和G-6-pase mRNA表達(dá)上調(diào)，P＜0.05。TO901317單獨(dú)應(yīng)用對(duì)HepG2內(nèi)PEPCK和G-6-pase mRNA表達(dá)無(wú)調(diào)節(jié)效應(yīng)，但SREBP-1c mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，P＜0.05。TO901317與PA共同孵育HepG2細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)了PA單獨(dú)孵育HepG2所致的PEPCK和G-6-pase mRNA的表達(dá)上調(diào)，P＜0.05。
　　結(jié)論:在胰島素抵抗下LXR活化后具

7、有顯著的降糖和增加胰島素敏感性的效應(yīng)，并有輕微的促成脂作用。在無(wú)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，LXR活化后對(duì)糖代謝無(wú)調(diào)節(jié)作用，促成脂作用仍然存在。LXR的降糖效應(yīng)可能與PEPCK和G-6-pasemRNA表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
　　第二部分 LXR活化后改善肝胰島素抵抗的分子機(jī)制
　　研究目的:探討胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下LXR活化后通過(guò)抗氧化應(yīng)激，抑制c-jun氨基末端激酶蛋白（JNK）信號(hào)通路的激活，從而改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制。
　　材

8、料和方法:(1)應(yīng)用免疫印跡法觀察TO901317活化LXR后，db/db小鼠和C57小鼠肝內(nèi)Akt蛋白磷酸化水平的改變及PA孵育下HepG2細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白磷酸化水平的改變。(2)用DHE法測(cè)定db/db和C57小鼠基線狀態(tài)下肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的水平。應(yīng)用DCFH法測(cè)定單獨(dú)應(yīng)用PA孵育HepG2后，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量。(3)測(cè)定LXR活化后各組小鼠（分組同第一部分）肝內(nèi)ROS產(chǎn)量的變化。測(cè)定聯(lián)合應(yīng)用PA和TO901317孵育H

9、epG2后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量的變化。(4)應(yīng)用免疫印跡法觀察LXR活化后各組小鼠肝臟JNK蛋白磷酸化水平的改變及HepG2在PA與TO901317共同孵育下細(xì)胞內(nèi)的JNK蛋白磷酸化水平的改變。
　　結(jié)果:(1) Western結(jié)果顯示，與db/db Con組比較，db/db TO組小鼠肝臟Akt蛋白的磷酸化水平降低，Akt總蛋白水平不變。與C57 Con組比較，C57 TO組小鼠肝臟Akt蛋白的磷酸化水平和Akt總蛋白水平均未出現(xiàn)

10、改變。在棕櫚酸孵育下，HepG2細(xì)胞的Akt蛋白磷酸化水平降低，Akt總蛋白水平不變。(2)基線狀態(tài)下db/db較C57小鼠肝組織內(nèi)ROS量顯著增多。LXR活化后，db/db TO組小鼠較db/db Con組肝臟ROS生成顯著減少。C57 TO組小鼠和C57 Con組相比，肝臟ROS水平?jīng)]有明顯改變。(3)PA可促進(jìn)HepG2中ROS生成。與PA單獨(dú)孵育HepG2比較，PA與TO901317共同孵育后HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量減少。(4

11、) Westem結(jié)果顯示，與db/db Con組比較，db/db TO組小鼠肝臟JNK蛋白磷酸化水平降低，JNK總蛋白水平不變。與C57 Con組比較，C57 TO組小鼠肝臟的JNK磷酸化水平和JNK總蛋白未出現(xiàn)改變。與PA單獨(dú)孵育HepG2相比，PA與TO901317共同孵育后HepG2細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化水平降低，JNK總蛋白不變。
　　結(jié)論:LXR活化后能夠通過(guò)減少游離脂肪酸誘導(dǎo)的ROS生成，抑制JNK應(yīng)激信號(hào)通路的活化，最終

12、恢復(fù)Akt的磷酸化，改善胰島素抵抗。
　　第三部分 LXR活化后對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)
　　研究目的:探索LXR信號(hào)通路抗氧化應(yīng)激的分子機(jī)制。
　　材料和方法:(1)分別應(yīng)用TO901317和N-乙酰半胱氨酸(NAC)孵育HepG2，應(yīng)用DCFH法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量的變化。(2) TO901317和NAC分別與PA聯(lián)合孵育HepG2后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量的變化。(3)應(yīng)用Western blot方法評(píng)估經(jīng)NAC預(yù)處理

13、后，PA孵育HepG2，細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平和總Akt蛋白量。(4)應(yīng)用Real-Time PCR的方法測(cè)定LXR活化后，db/db小鼠肝細(xì)胞和PA和TO901317共同孵育下的HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:(1)單獨(dú)應(yīng)用TO901317和單獨(dú)應(yīng)用抗氧化劑NAC孵育細(xì)胞，均能顯著降低ROS生成，P＜0.05。(2) TO901317和NAC均能減少PA引發(fā)的ROS過(guò)度生成。(3) Western

14、結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理后增加了HepG2細(xì)胞內(nèi)因PA降低的Akt蛋白磷酸化水平。(4) Real-Time結(jié)果顯示，與Con組相比，db/db TO組小鼠肝臟中NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2 related factor2，Nrf2)和超氧化物歧化酶Mn-SODmRNA的表達(dá)顯著增高;HepG2中也發(fā)現(xiàn)Nrf2和Mn-SOD mRNA表達(dá)增加。
　　結(jié)論:LXR的專屬激動(dòng)劑TO901317可能是一種未被發(fā)現(xiàn)的還原劑，LXR信號(hào)通