新基因KLF14過表達(dá)影響肝糖代謝及胰島素抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分小鼠KLF14基因真核過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。
　　目的:構(gòu)建及鑒定小鼠pIRES2-EGFP-KLF14真核過表達(dá)載體。
　　方法:首先從小鼠組織提取總RNA，通過RT-PCR的方法獲取目的DNA，再經(jīng)膠回收、純化、雙酶切以及與過表達(dá)載體pIRES2-EGFP連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-KLF14，最后利用雙酶切以及DNA測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果

2、:重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，成像顯示兩條帶，大片段約5.3Kb（pIRES2-EGFP線性化質(zhì)粒）和小片段約1000bp（KLF14的PCR產(chǎn)物），初步鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。DNA測序結(jié)果經(jīng)BLAST進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示其核酸序列與GenBank中小鼠KLF14基因的CDS區(qū)序列完全一致，進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了小鼠pIRES2-EGFP-KLF14真核過表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究KLF1

3、4過表達(dá)對糖代謝以及胰島素抵抗的影響提供技術(shù)手段和奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　第二部分KLF14基因mRNA在小鼠各組織的分布情況分析。
　　目的:觀察轉(zhuǎn)錄水平上KLF14基因在健康C57BL/6J小鼠體內(nèi)各組織的表達(dá)分布情況。
　　方法:將小鼠頸椎脫臼處死后，首先取其多處組織如心臟、肝臟、腎臟、腦、脾臟、肺、胃、腸、附睪、骨骼肌、脂肪，并提取各組織RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA;然后通過實(shí)時熒光定量PCR(real-timeP

4、CR)的方法，檢測KLF14基因mRNA在各組織的表達(dá)分布情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)錄水平上KLF14基因在小鼠體內(nèi)普遍表達(dá)，其mRNA相對表達(dá)量由高到低依次為心臟、骨骼肌、肝臟、脂肪、小腸、腎臟、腦、肺、胃、脾、附睪。
　　結(jié)論:KLF14基因在小鼠體內(nèi)普遍表達(dá)，其中心臟、骨骼肌、肝臟等組織的相對表達(dá)量較高，為探討KLF14在糖代謝中的調(diào)控作用，我們選擇肝細(xì)胞作為體外研究對象，以進(jìn)一步研究KLF14的生理功能。

5、r>　　第三部分KLF14基因過表達(dá)對相關(guān)信號通路中關(guān)鍵信號分子的影響研究。
　　目的:觀察KLF14過表達(dá)對InsR/IRS/AKT/GSK-3β以及AMPK/TORC2/PEPCK信號通路中關(guān)鍵信號分的影響，探討KLF14影響糖代謝以及胰島素抵抗的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:建立KLF14過表達(dá)的體外研究肝癌細(xì)胞模型，分組（空白對照組、INS處理組、KLF14轉(zhuǎn)染組和INS+KLF14處理組）并分別加以處理，然后采用we

6、stern blot的方法，檢測KLF14對兩條信號通路中關(guān)鍵信號分子的影響。采用[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取法檢測肝癌細(xì)胞對葡萄糖的攝取率。
　　結(jié)果:INS處理hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞后，KLF14轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，除p-InsR表達(dá)無明顯改變外，其他指標(biāo)如p-IRS、p-AKT、p-AMPK、p-TORC2表達(dá)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01):另外，糖原合成關(guān)鍵酶p-GSK3β表達(dá)亦明顯增加，而糖異