SARS-CoV核衣殼蛋白的功能研究及RNA干擾的初步應(yīng)用.pdf

1、　　本課題的一部分工作是探討SARS-CoVN蛋白可能的生物學(xué)功能，具體研究如下：1)構(gòu)建帶myc標(biāo)簽和HA標(biāo)簽的N蛋白真核表達(dá)載體，利用免疫熒光染色和N蛋白的pEGFP表達(dá)載體檢測(cè)初步確定N蛋白定位在細(xì)胞漿。2)通過(guò)免疫沉淀發(fā)現(xiàn)293細(xì)胞內(nèi)一分子量大約90KDa的未知蛋白與N蛋白有相互作用。3)通過(guò)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)SARS-CoVN蛋白與其RNA聚合酶有相互作用，且推測(cè)一個(gè)聚合酶分子有可能和多個(gè)N蛋白分子作用。4)利用N蛋白磷酸化抗體檢

2、測(cè)發(fā)現(xiàn)N蛋白存在絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化修飾，并初步證實(shí)N蛋白可以抑制ERK/MAPK通路和PI3K/Akt通路及激活凋亡信號(hào)分子。5)最后，我們用N蛋白特異性抗體驗(yàn)證了該實(shí)驗(yàn)所用真核載體表達(dá)的N蛋白是特異的SARS-CoV核衣殼蛋白，證明了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是有意義的。該課題旨在尋找N蛋白與病毒致病性的關(guān)系以及SARS病毒的致病機(jī)理，對(duì)有效地預(yù)防、診斷和治療SARS具有重要的意義。　　RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的

3、序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。由于RNAi技術(shù)具有高效、專(zhuān)一、用量少、毒性小的特點(diǎn)，因此近年來(lái)已經(jīng)作為一種抑制基因表達(dá)的工具被廣泛的應(yīng)用?！　”菊n題的另一部分工作是設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對(duì)SARS-CoVN蛋白的特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并在細(xì)胞水平上證實(shí)了siRNA對(duì)N蛋白的表達(dá)存在干擾效應(yīng)及干擾的劑量效應(yīng)。該工作為SARS冠狀病毒N蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)，為研究N蛋白和SARS-CoV致病性的關(guān)系提供了新的平臺(tái)，為預(yù)防、治療SARS提供了新