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文檔簡介
1、本文針對目前病毒樣顆粒(Virus-like particles.VLPs)研究中的一個熱點——內含特定RNA的MS2VLPs的原核和真核表達及應用研究兩個重要問題進行探討,共由兩部分研究組成。
手足口病(hand foot and mouth disease.HFMD)是由腸道病毒感染導致的臨床癥候群,是全球性傳染病,全世界大部分地區(qū)均有該病流行的文獻報道。腸道71型病毒(enterovirus 71,EV71)與柯薩奇
2、16型病毒(coxsackievirus A16.CA16)感染交替出現(xiàn),成為HFMD的主要病原體。目前廣泛用于手足口病毒(hand foot and mouth virus.HFMV)核酸檢測的質控品和標準品多為質粒、滅活病毒、經特殊處理的RNA和患者陽性血清。它們具有易被核糖核酸酶(ribonulcease,RNase)降解、具有生物傳染危險性、穩(wěn)定性較差和異質性等缺點。因此,我們應用傳統(tǒng)的MS2噬菌體克隆程序,表達一種耐RNase
3、的內嵌腸道病毒RNA通用片段和HFMVRNA片段的嵌合型MS2VLPs,作為腸道病毒和HFMV核酸檢測的新型質控品和標準品。笫一部分旨在研究內含HFMVRNA的MS2VLPs的原核表達及其作為病毒核酸檢測室間質量評價樣本的應用研究。本研究構建了包含了三段靶序列(EV71-VLPs和EV-VLPs靶序列均來自EV71病毒,CA16-VLPs靶序列來自CA16病毒,其中EV-VLPs靶序列為腸道病毒通用序列)的三個VLPs,這些VLPs經過
4、穩(wěn)定性和安全性等一系列的特征鑒定和驗證后,用國際標準品予以賦值,并且將其應用于評價各實驗室檢測EV71和CA16病毒核酸的室間質量評價(External quality assessment,EQA)。EQA血清盤由20個樣本組成,包括由不同濃度EV-VLPs和不同濃度的EV71-VLPs或CA16-VLPs的組合成的14份陽性標本,2份這三種VLPs組成的模擬EV71和CA16混合感染標本,和4份陰性樣本。這20份標本(內附指導說明)
5、通過快遞常溫運送至全國54個負責HFMV分子檢測的網(wǎng)絡實驗室,要求其在規(guī)定的時間內,采用其實驗室常規(guī)檢測所用的方法進行檢測后,按要求回報結果。
研究結果表明,我們通過分子克隆和原核表達方法,成功構建了表達內含HFMVRNA的三個VLPs,VLPs經過一系列特征驗證,具有耐RNA酶、無生物傳染危險性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。這些VLPs作為病毒替代物首次應用于全國HFMV檢測的EQA。我們共收到來自41個參與實驗室的41份反饋檢測報
6、告,結果表明87.8%(36/41)實驗室使用的是商品檢測試劑盒(real-time RT-PCR法),用室內自配RT-PCR(in-house RT-PCR法)試劑的實驗室只有12.2%(5/41)。各實驗室的檢測結果差異較大,僅31.7%(13/41)實驗室的檢測結果與預期結果完全相符(100分),29.3%(12/41)的實驗室檢測能力有待進一步提高(<90分)。23個實驗室報告了假陰性結果,其假陰性率為7.3%(101/1.39
7、4),EV71的檢測敏感性(82.1%)明顯低于EV(97.4%)或CA16(95.1%)(P<0.05)。因此,本研究表達的VLPs完全可以替代病毒作為室間質量評價的樣本,全國HFMV分子檢測的網(wǎng)絡實驗室在HFMV分子診斷方面有較為明顯的不足之處,如一些商業(yè)試劑盒的低敏感性和個別參與實驗室的低檢測能力。因此,EQA應該作為一項長期的工作被定期嚴格執(zhí)行,以幫助監(jiān)測實驗室在HFMV的檢測能力和提高來自不同實驗室結果的一致性,使之具有可比性
8、。另外,由于RNA病毒的易突變性,在以后的EQA樣本中還應該增加HFMV更多的基因型。
用RNA替代DNA作為基因疫苗是近年來研究的熱點和趨勢,因為RNA不會整合到宿主細胞基因組,也不會引起自身免疫病等嚴重的副作用。當前mRNA疫苗的研究主要集中在治療性腫瘤疫苗和免疫治療的研究。釀酒酵母細胞表達的包裝外源功能性mRNA的MS2VLPs具有使RNA穩(wěn)定、高體內轉運效率和安全的特性。本課題的前期研究已經證明,基于MS2噬菌體衣
9、殼蛋白的VLPs可作為mRNA新型遞送載體,免疫小鼠后可誘導針對編碼該mRNA表達蛋白的特異性抗體的產生。因此,本項研究采用釀酒酵母表達系統(tǒng)獲得重組MS2VLPs作為腫瘤治療性mRNA疫苗的新型遞送載體,MS2VLPs內裝載有腫瘤相關抗原如癌胚抗原(carcino embryonic antigen,CEA)編碼mRNA(CEA-RNA)。建立小鼠結腸癌動物模型和轉CEA基因動物模型,來研究其誘導的免疫效果和免疫保護能力。第二部分旨在研
10、究內含癌胚抗原(CEA)-mRNA的MS2VLPs的真核表達及其作為結直腸癌治療性疫苗的研究。本研究將編碼CEA蛋白的cDNA序列插入pMS2構建能包裝CEA mRNA的pMS2-CEAVLPs的表達載體。經測序鑒定正確后,轉化到釀酒酵母YPH499細胞內,并進一步誘導表達MS2 VLps。純化后,采用瓊脂糖凝膠電泳和電子顯微鏡鑒定,并對上述VLPs進行RT-PCR擴增,以驗證VLPs是否包裝了全長的CEA-RNA。提取pMS2-CEA
11、 VLPs包裝的RNA,使用DOTAP轉染試劑轉染至哺乳動物細胞,使用Western Blot法檢測CEA蛋白的表達,同時計算pMS2-CEA VLPs誘導的效應細胞對MC38-CEA細胞的殺傷率。取50μg純化的pMS2-CEA VLPs,免疫6-8周C57BL/6小鼠和結直腸癌模型小鼠。三次免疫后取小鼠尾靜脈血用ELISA法檢測抗原特異性抗體的產生和用ELISPOT法檢測細胞免疫應答水平(IFN-γ)以及觀察荷瘤小鼠的生存時間。
12、r> 研究結果表明,采用單質粒表達系統(tǒng),在釀酒酵母YPH499細胞內MS2衣殼蛋白成功的包裝了CEA mRNA,形成了MS2-CEA VLPs。提取RNA轉染哺乳動物細胞(MC38細胞和CHO細胞)后可檢測到目的蛋白的表達;在效靶比為20∶1和40∶1時,pMS2-CEA VLPs誘導的效應細胞對MC38-CEA細胞的殺傷率分別為38.7%和43.6%,而對MC38細胞的無明顯殺傷作用,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。我們還進一
13、步證實了純化后的pMS2-CEA VLPs免疫C57BL/6小鼠后,可以誘導抗原特異性體液和細胞免疫應答,并對荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用。另外觀察腫瘤組小鼠的生存時間發(fā)現(xiàn),免疫組小鼠的生存時間明顯延長。綜上所述,本研究成功構建了MS2 VLPs的釀酒酵母表達載體pMS2-CEA,并證實釀酒酵母細胞表達系統(tǒng)可成功地表達MS2 VLPs。同時也證明了釀酒酵母細胞表達的MS2 VLPs可作為mRNA的新型遞送載體,可以誘導抗原特異性體液免疫
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