內(nèi)含特定RNA的MS2病毒樣顆粒的原核和真核表達及應用研究.pdf

1、本文針對目前病毒樣顆粒(Virus-like particles.VLPs)研究中的一個熱點——內(nèi)含特定RNA的MS2VLPs的原核和真核表達及應用研究兩個重要問題進行探討，共由兩部分研究組成。
　　 手足口病(hand foot and mouth disease.HFMD)是由腸道病毒感染導致的臨床癥候群，是全球性傳染病，全世界大部分地區(qū)均有該病流行的文獻報道。腸道71型病毒(enterovirus 71，EV71)與柯薩奇

2、16型病毒(coxsackievirus A16.CA16)感染交替出現(xiàn)，成為HFMD的主要病原體。目前廣泛用于手足口病毒(hand foot and mouth virus.HFMV)核酸檢測的質(zhì)控品和標準品多為質(zhì)粒、滅活病毒、經(jīng)特殊處理的RNA和患者陽性血清。它們具有易被核糖核酸酶(ribonulcease，RNase)降解、具有生物傳染危險性、穩(wěn)定性較差和異質(zhì)性等缺點。因此，我們應用傳統(tǒng)的MS2噬菌體克隆程序，表達一種耐RNase

3、的內(nèi)嵌腸道病毒RNA通用片段和HFMVRNA片段的嵌合型MS2VLPs，作為腸道病毒和HFMV核酸檢測的新型質(zhì)控品和標準品。笫一部分旨在研究內(nèi)含HFMVRNA的MS2VLPs的原核表達及其作為病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價樣本的應用研究。本研究構(gòu)建了包含了三段靶序列（EV71-VLPs和EV-VLPs靶序列均來自EV71病毒，CA16-VLPs靶序列來自CA16病毒，其中EV-VLPs靶序列為腸道病毒通用序列）的三個VLPs，這些VLPs經(jīng)過

4、穩(wěn)定性和安全性等一系列的特征鑒定和驗證后，用國際標準品予以賦值，并且將其應用于評價各實驗室檢測EV71和CA16病毒核酸的室間質(zhì)量評價(External quality assessment，EQA)。EQA血清盤由20個樣本組成，包括由不同濃度EV-VLPs和不同濃度的EV71-VLPs或CA16-VLPs的組合成的14份陽性標本，2份這三種VLPs組成的模擬EV71和CA16混合感染標本，和4份陰性樣本。這20份標本（內(nèi)附指導說明）

5、通過快遞常溫運送至全國54個負責HFMV分子檢測的網(wǎng)絡實驗室，要求其在規(guī)定的時間內(nèi)，采用其實驗室常規(guī)檢測所用的方法進行檢測后，按要求回報結(jié)果。
　　 研究結(jié)果表明，我們通過分子克隆和原核表達方法，成功構(gòu)建了表達內(nèi)含HFMVRNA的三個VLPs，VLPs經(jīng)過一系列特征驗證，具有耐RNA酶、無生物傳染危險性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。這些VLPs作為病毒替代物首次應用于全國HFMV檢測的EQA。我們共收到來自41個參與實驗室的41份反饋檢測報

6、告，結(jié)果表明87.8％(36/41)實驗室使用的是商品檢測試劑盒（real-time RT-PCR法），用室內(nèi)自配RT-PCR(in-house RT-PCR法)試劑的實驗室只有12.2%(5/41)。各實驗室的檢測結(jié)果差異較大，僅31.7%(13/41)實驗室的檢測結(jié)果與預期結(jié)果完全相符（100分），29.3%(12/41)的實驗室檢測能力有待進一步提高（＜90分）。23個實驗室報告了假陰性結(jié)果，其假陰性率為7.3%(101／1.39

7、4)，EV71的檢測敏感性(82.1%)明顯低于EV(97.4%)或CA16(95.1%)(P＜0.05)。因此，本研究表達的VLPs完全可以替代病毒作為室間質(zhì)量評價的樣本，全國HFMV分子檢測的網(wǎng)絡實驗室在HFMV分子診斷方面有較為明顯的不足之處，如一些商業(yè)試劑盒的低敏感性和個別參與實驗室的低檢測能力。因此，EQA應該作為一項長期的工作被定期嚴格執(zhí)行，以幫助監(jiān)測實驗室在HFMV的檢測能力和提高來自不同實驗室結(jié)果的一致性，使之具有可比性

8、。另外，由于RNA病毒的易突變性，在以后的EQA樣本中還應該增加HFMV更多的基因型。
　　 用RNA替代DNA作為基因疫苗是近年來研究的熱點和趨勢，因為RNA不會整合到宿主細胞基因組，也不會引起自身免疫病等嚴重的副作用。當前mRNA疫苗的研究主要集中在治療性腫瘤疫苗和免疫治療的研究。釀酒酵母細胞表達的包裝外源功能性mRNA的MS2VLPs具有使RNA穩(wěn)定、高體內(nèi)轉(zhuǎn)運效率和安全的特性。本課題的前期研究已經(jīng)證明，基于MS2噬菌體衣

9、殼蛋白的VLPs可作為mRNA新型遞送載體，免疫小鼠后可誘導針對編碼該mRNA表達蛋白的特異性抗體的產(chǎn)生。因此，本項研究采用釀酒酵母表達系統(tǒng)獲得重組MS2VLPs作為腫瘤治療性mRNA疫苗的新型遞送載體，MS2VLPs內(nèi)裝載有腫瘤相關抗原如癌胚抗原(carcino embryonic antigen,CEA)編碼mRNA(CEA-RNA)。建立小鼠結(jié)腸癌動物模型和轉(zhuǎn)CEA基因動物模型，來研究其誘導的免疫效果和免疫保護能力。第二部分旨在研

10、究內(nèi)含癌胚抗原(CEA)-mRNA的MS2VLPs的真核表達及其作為結(jié)直腸癌治療性疫苗的研究。本研究將編碼CEA蛋白的cDNA序列插入pMS2構(gòu)建能包裝CEA mRNA的pMS2-CEAVLPs的表達載體。經(jīng)測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YPH499細胞內(nèi)，并進一步誘導表達MS2 VLps。純化后，采用瓊脂糖凝膠電泳和電子顯微鏡鑒定，并對上述VLPs進行RT-PCR擴增，以驗證VLPs是否包裝了全長的CEA-RNA。提取pMS2-CEA

11、 VLPs包裝的RNA，使用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞，使用Western Blot法檢測CEA蛋白的表達，同時計算pMS2-CEA VLPs誘導的效應細胞對MC38-CEA細胞的殺傷率。取50μg純化的pMS2-CEA VLPs，免疫6-8周C57BL/6小鼠和結(jié)直腸癌模型小鼠。三次免疫后取小鼠尾靜脈血用ELISA法檢測抗原特異性抗體的產(chǎn)生和用ELISPOT法檢測細胞免疫應答水平(IFN-γ)以及觀察荷瘤小鼠的生存時間。

12、r>　　 研究結(jié)果表明，采用單質(zhì)粒表達系統(tǒng)，在釀酒酵母YPH499細胞內(nèi)MS2衣殼蛋白成功的包裝了CEA mRNA，形成了MS2-CEA VLPs。提取RNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞（MC38細胞和CHO細胞）后可檢測到目的蛋白的表達；在效靶比為20∶1和40∶1時，pMS2-CEA VLPs誘導的效應細胞對MC38-CEA細胞的殺傷率分別為38.7%和43.6%，而對MC38細胞的無明顯殺傷作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。我們還進一

13、步證實了純化后的pMS2-CEA VLPs免疫C57BL／6小鼠后，可以誘導抗原特異性體液和細胞免疫應答，并對荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用。另外觀察腫瘤組小鼠的生存時間發(fā)現(xiàn)，免疫組小鼠的生存時間明顯延長。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了MS2 VLPs的釀酒酵母表達載體pMS2-CEA，并證實釀酒酵母細胞表達系統(tǒng)可成功地表達MS2 VLPs。同時也證明了釀酒酵母細胞表達的MS2 VLPs可作為mRNA的新型遞送載體，可以誘導抗原特異性體液免疫