Klebsiella pneumoniae甘油脫水酶的分子改造研究.pdf

1、本論文通過理性設計進化的方法(定點突變、飽和突變和多點聯(lián)合突變)研究酶的活性中心位點和保守區(qū)域位點的突變對酶活力的影響，為對甘油脫水酶分子的進一步改造提供理論依據(jù)。
　　 以PDB數(shù)據(jù)庫中與本實驗中K. pneumoniae甘油脫水酶同源性最高的甘油脫水酶的三維結構分子(PDB liwp)為模板，利用Swissmodel進行同源建模，同時利用prosa2003能量分析軟件對相應氨基酸的替換進行能量分析，分析結果顯示有17個突變酶

2、的能量相對于原始酶降低，另外11個突變酶的能量則相對于原始酶升高。
　　 以本實驗室構建的整合有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)甘油脫水酶基因的重組質粒pSE380—gldABC為模板，利用反向PCR對該基因進行理性分子改造，共獲得28個突變子，對帶有突變質粒的大腸桿菌工程菌株進行誘導表達，經(jīng)鎳離子親和層析與Sephacryl S300凝膠層析純化后，SDS—PAGE分析顯示出均一的三條特異性蛋白質表達

3、條帶。測定純化后獲得的突變酶的酶學性質。結果顯示：在28個突變酶中，有5個突變酶在甘油和1，2—丙二醇兩種底物條件下均無酶活，以甘油為底物時，酶活力得到提高的突變酶有18個，其中T234S、A119E、1498N+Q42S+Y525W和D58Y+F60Y的比活分別提高至原始酶的5.99、5.46、5.09和4.83倍；以1，2—丙二醇為底物時，酶活力得到提高的有17個，其中，T234S、Y525F、A119E和Y525F+D58Y的比活