GluR6-KA受體的活化引起B(yǎng)cl-2降解機(jī)制和作用的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)室的過去研究指出,大鼠側(cè)腦室給予谷氨酸受體GluR6激動(dòng)劑海人藻酸(KA)模擬癲癇可以導(dǎo)致Bcl-2的降解,但是降解的機(jī)制尚未進(jìn)一步研究。本文擬研究KA是否通過其受體導(dǎo)致Bcl-2去亞硝基化,從而促使其泛素化,最終引起B(yǎng)cl-2降解,并觀察一些藥物NS102、GSNO、SNP、MG132能否抑制Bcl-2去亞硝基化和泛素化,從而抑制Bcl-2降解,并且保護(hù)了神經(jīng)元。
　　 方法:在腦室注射海人藻酸模擬的大鼠癲癇模型中

2、,采用RT-PCR研究Bcl-2mRNA水平的變化,免疫印跡、免疫組化研究Bcl2蛋白的表達(dá)量的變化,采用生物素轉(zhuǎn)化法研究該蛋白的半胱氨酸巰基亞硝基化水平變化,采用免疫沉淀的方法檢測(cè)其泛素化水平的變化,采用熒光標(biāo)記酶底物檢測(cè)蛋白酶體活性,采用焦油紫染色、TUNEL染色研究海馬CA1和CA3/DG區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞丟失和凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 1.側(cè)腦室途徑給予成年大鼠的KA降解了海馬CA1、CA3/DG區(qū)Bcl-2,且降解

3、具有時(shí)間和濃度依賴性。KA受體亞基GluR6的抑制劑NS102可以抑制Bcl-2的降解。
　　 2.靜息條件下海馬CA1、CA3/DG區(qū)Bcl-2具有一定的翻譯后亞硝基化修飾水平。KA刺激3h后Bcl-2亞硝基化水平降低,即發(fā)生了去亞硝基化。KA受體亞基GluR6抑制劑NS102可以抑制Bcl-2去亞硝基化。
　　 3.KA作用3h后Bcl-2的泛素化水平增加,并且蛋白酶體抑制劑MG132可以抑制Bcl-2的降解。說明B

4、cl-2降解和泛素蛋白酶體途徑有關(guān)。推測(cè)Bcl-2亞硝基化和泛素化有關(guān)。結(jié)果證實(shí)給予亞硝基化外源性供體GSNO、SNP對(duì)Bcl-2的泛素化水平具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,可以抑制Bcl-2降解。
　　 4.KA活化激活了Fas受體,為了研究Fas受體是否涉及Bcl-2降解的機(jī)制,給予FasL反義寡核苷酸處理阻斷Fas通路,結(jié)果不能抑制Bcl-2去亞硝基化造成的泛素化降解,說明Fas受體不介導(dǎo)受體偶聯(lián)的Bcl-2去亞硝基化,真正偶聯(lián)Bcl-2

5、去亞硝基化的很可能就是GluR6。
　　 5.外源性NO供體GSNO和蛋白酶體抑制劑MG132除了能夠抑制Bcl-2降解外還具有抑制KA誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c釋放和caspase-3激活的作用。
　　 6.免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步揭示了Bcl-2降解所涉及的相關(guān)機(jī)制。
　　 7.焦油紫染色的結(jié)果表明抑制Bcl-2降解具有抗KA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元遲發(fā)性死亡作用。
　　 8.TUNEL凋亡檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了焦油紫染色