cGAS信號通路介導(dǎo)牛分枝桿菌激活小鼠髓源樹突狀細胞免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）是一種導(dǎo)致牛結(jié)核病的典型胞內(nèi)病原菌，可跨物種傳播給人和其他哺乳動物。在全球造成了重大的經(jīng)濟損失，并威及社會公共衛(wèi)生安全。近期，美籍華人科學(xué)家陳志堅教授課題組發(fā)現(xiàn)了一種新型的DNA識別分子，環(huán)磷酸鳥苷-磷酸腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)，cGAS屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶成員，可特異性識別細胞質(zhì)中的雙鏈DNA，催化合成cGAMP，進而依賴ST

2、ING介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。長期以來的研究都將巨噬細胞作為結(jié)核菌感染的主要宿主細胞，但隨著樹突狀細胞生理功能的逐步明了，其在結(jié)核菌感染中的作用越來越受到人們的重視。本實驗旨在探究小鼠髓源樹突狀細胞（murine bone marrow derived dendritic cell，BMDC）感染牛分枝桿菌后，cGAS信號通路的表達，以及對BMDC成熟及活化的調(diào)控，進一步探究感染后CD4+T細胞的免疫應(yīng)答，闡明相關(guān)作用機制。

3、
　　1.利用體外誘導(dǎo)的方法，原代分離BMDC，且純度達到90％以上。通過Western blot檢測感染后BMDC中cGAS及其下游相關(guān)蛋白的表達情況，利用免疫熒光顯微鏡觀察IRF3的入核現(xiàn)象。結(jié)果顯示，感染后cGAS、p-TBK1的蛋白表達量上升，STING表現(xiàn)出雙條帶，IRF3入核現(xiàn)象明顯。而利用siRNA沉默cGAS后，下游相關(guān)蛋白表達均受到抑制，IRF3入核現(xiàn)象減弱。
　　2.利用流式細胞術(shù)以及Ⅰ型干擾素受體阻斷劑

4、，檢測感染后BMDC表面標(biāo)志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ的表達情況，利用ELISA試劑盒檢測細胞上清中IFN-β、IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α的分泌情況。結(jié)果顯示，感染后表面標(biāo)志物表達量顯著上升，而cGAS沉默后以及Ⅰ型干擾素受體阻斷后，表達量均受到抑制。細胞因子的變化趨勢基本與之相同，但TNF-α不受阻斷劑的影響。添加外源性IFN-β后TNF-α、IL-12p70分泌量上調(diào)，而IL-10、IL-6則

5、無明顯變化。
　　3.利用免疫磁珠方法從小鼠的脾臟特異性分離出CD4+T細胞，添加示蹤性熒光標(biāo)簽后，建立BMDC與CD4+T細胞共培養(yǎng)體系，通過流式細胞術(shù)和ELISA技術(shù)分別檢測CD4+T細胞的增殖情況以及IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示，感染組可顯著誘導(dǎo)CD4+T細胞的增殖，而阻斷Ⅰ型干擾素受體后擴增能力下降。感染后IFN-γ表達量顯著上調(diào)，而在阻斷組中則受到明顯抑制。
　　綜上所述，本研究表明，cGAS信號通路存在于BMDC中