miR-146a在結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中對TLRs信號通路的免疫調控作用研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌（Tuberculosis，TB）感染引起的一種慢性消耗性人獸共患病，全世界約有20億人感染該病，其中10％有可能發(fā)展為活動性肺結核。結核分枝桿菌的致病機理十分復雜，尤其是近年來耐藥和耐多藥結核菌的出現(xiàn)，給臨床治療結核病帶來很大的困難，特別是和其他疾病混合感染（如HIV）增加了患者的死亡率。雖然卡介苗目前是預防結核病的唯一手段，但卡介苗的保護率很低，而且僅對兒童和未成年人有效，對成年人幾乎沒有保護作用。因此，尋求新

2、的有效途徑來防治結核病顯得尤為重要。近年來發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型上皮細胞(AECⅡ)作為肺臟的“物理屏障”，同肺泡巨噬細胞一起在機體對抗Mtb感染中發(fā)揮著重要的免疫調控功能。而miRNA是作為一種內源性具有調控功能的非編碼RNA，在機體的發(fā)育、生理和病理發(fā)生過程中有著重要的調控功能。miRNA可以影響宿主抵抗Mtb的感染過程，其異常表達也與結核病的發(fā)生密切相關。眾所周知，Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)作為先天免

3、疫中的模式識別受體(PRR)，是連接先天免疫和獲得性免疫的“橋梁”，能夠監(jiān)視與識別各種不同的病原相關分子模式(PAMP)，是機體抵抗病原菌（如Mtb）感染的“第一道屏障”。因此，為了揭示miRNA在肺臟AECⅡ細胞抗Mtb感染中與TLRs信號通路間的相互調控作用，本研究以AECⅡ細胞為細胞模型，建立結核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv和減毒株BCG細胞-細菌互作模型，在前期測定miRNA差異表達譜的基礎上，分析了Mtb感染前后AECⅡ細

4、胞中TLRs信號通路的變化，以及miR-29a,miR-146a和miR-200c的表達情況，并進一步分析了在AECⅡ細胞中過表達miR-146a對TLRs信號通路的影響，獲得了一下結果:
　　(1)利用H37Rv和BCG分別感染AECⅡ細胞株A549，分析在感染6h，12h和24h時，檢測TLRs信號通路、促炎細胞因子與miR-29a、miR-146a和miR-200c的表達變化。試驗結果表明，A549細胞中TLR2/4、NFκ

5、B、MyD88的mRNA和蛋白表達水平在感染6h時顯著升高，且H37Rv感染組高于BCG感染組;而促炎細胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8和IL-12α的mRNA表達水平隨著感染時間升高，且H37Rv感染組TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-8的表達顯著高于BCG感染組，IL-12α差異不顯著，而在H37感然組中IL-6在24h顯著下降。miR-146a隨著感染時間表達顯著升高，且H37Rv高于BCG; miR-29a

6、在感染6h時表達量H37Rv顯著高于BCG，但在12h和24h時，BCG感染組miR-29a表達量較6h時顯著升高，而H37Rv感染組miR-29a表達量顯著下調，但這兩個感染組12h與24h時間點的組內差異不顯著; miR-200c在BCG感染組在3個時間點先降低后升高，表現(xiàn)為感染后表達抑制，而在H37Rv感染組內表達差異不顯著，且表達量低于BCG感染組6h和24h的相應時間點。這為進一步分析在Mtb感染肺臟上皮Ⅱ型細胞中miR-14

7、6a與TLRs信號通路的免疫應答機制奠定了基礎。
　　(2)基于miR-146a作為TLRs信號通路的負調控因子，其表達量在Mtb感染AECⅡ細胞中呈上調趨勢的試驗結果，本實驗構建并包裝過表達miR-146a腺病毒載體，并分析了A549細胞中過表達miR-146a時在Mtb感染中，miR-146a對TLRs信號通路及細胞因子的表達調控作用，該試驗結果表明，構建的過表達miR-146a腺病毒載體能夠在293T細胞和A549細胞中過表

8、達miR-146a;當過表達miR-146a時，在BCG感染組中TLR2的表達表現(xiàn)為感染后顯著抑制，而H37Rv感染組中TLR2表達差異不顯著;TLR4在BCG和H37Rv感染組中均表現(xiàn)為顯著下調，這有可能是在AECⅡ細胞中，TLR2是以同源二聚體形式識別BCG，以TLR2/TLR4異源二聚體形式識別H37Rv。過表達miR-146a時，在BCG和H37Rv感染組中對TLR信號通路的下游分子MyD88、TRAF6、NF-κB和促炎細胞因