斷奶應(yīng)激對仔豬腸上皮細胞緊密連接和p38MAPK的影響.pdf

1、腸道不僅是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，而且是機體十分重要的防御屏障。仔豬消化道組織和功能發(fā)育尚未成熟，斷奶應(yīng)激導致的生理、營養(yǎng)和環(huán)境狀況的突然改變易造成其腸道功能紊亂，使仔豬食欲差、消化不良、腹瀉、生長受阻、死亡等，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失。大量研究表明，斷奶應(yīng)激狀態(tài)下仔豬腸形態(tài)受損，消化吸收能力下降。然而關(guān)于早期斷奶引起仔豬腸上皮屏障變化的報道還較少，對于斷奶應(yīng)激引起仔豬腸道損傷的信號轉(zhuǎn)導機制尚不清楚。因此，我們有必要研究早期斷奶對仔

2、豬腸上皮屏障的影響。腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個病理機制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)信號道路的調(diào)節(jié)有關(guān)。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)是MAPK家族成員之一，p38 MAPK屬于應(yīng)激活化蛋白激酶，可被促炎因子(如TNF-α、IL-1)、應(yīng)激刺激（紫外線、H2O2、熱休克、

3、高滲、蛋白合成抑制劑等）以及脂多糖激活。p38 MAPK信號通路參與介導細胞的增殖和分化、細胞的凋亡和死亡等生理病理過程，并與炎癥調(diào)控反應(yīng)機制密切相關(guān)。p38 MAPK是否參與斷奶應(yīng)激引起的仔豬腸道損傷過程目前尚未見報道。
　　 本文研究了斷奶應(yīng)激對仔豬腸上皮屏障、緊密連接和p38MAPK的影響，為合理制定配方，研發(fā)仔豬新型綠色飼料添加劑提供參考。并通過p38 MAPK抑制劑SB203580預處理斷奶仔豬，研究p38 MAPK是

4、否在斷奶應(yīng)激引起的仔豬腸道損傷中發(fā)揮作用，為防治仔豬早期斷奶應(yīng)激引起的腸道損傷提供新的思路。
　　 試驗一以21日齡仔豬為研究對象，試驗選取體況相似、胎次接近的同品種母豬12窩，產(chǎn)仔數(shù)為9～11頭。仔豬從7日齡開始誘食并哺乳。在21日齡，每窩選取2～3頭仔豬斷奶后在保育舍飼養(yǎng)，為斷奶組，每窩剩下的仔豬不斷奶繼續(xù)哺乳至35日齡，為哺乳組。仔豬自由采食和飲水，試驗期為14d。分別于22、24、28和35日齡，每次每組選取6頭仔豬。仔

5、豬前腔靜脈取血，肝素抗凝，制備血漿，-80℃保存，然后屠宰仔豬取樣。利用Ussing chamber技術(shù)、HE切片、電鏡、Western blotting等方法，研究了斷奶應(yīng)激對仔豬腸上皮屏障和緊密連接的影響，同時檢測腸道p38MAPK磷酸化的活化情況。
　　 試驗二按照科學試驗要求選取產(chǎn)仔數(shù)為9～11頭的母豬6窩，仔豬從7日齡開始誘食并哺乳。在21日齡，每窩選取1頭仔豬斷奶后在保育舍飼養(yǎng)，為斷奶組;每窩選取1頭仔豬斷奶前30

6、min腹腔注射p38MAPK抑制劑(2mg/kgSB203580)，為抑制劑組;每窩剩下的仔豬不斷奶繼續(xù)哺乳，為哺乳組。哺乳組和斷奶組注射等量的生理鹽水。仔豬自由采食和飲水，按常規(guī)程序進行管理。于斷奶后36 h屠宰仔豬取樣待測，每組6頭仔豬。通過p38MAPK抑制劑SB203580預處理斷奶仔豬，研究p38MAPK抑制劑對斷奶仔豬腸道通透性和腸黏膜促炎因子水平的影響。
　　 試驗結(jié)果如下:
　　 1.與哺乳組相比，斷奶組

7、空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度在22、24和28日齡均顯著降低(P＜0.05)，隱窩深度均顯著提高(P＜0.05)，35日齡上述指標與哺乳組差異不顯著(P＞0.05)。斷奶組在斷奶后的不同時間腸形態(tài)也發(fā)生了變化，斷奶仔豬24和28日齡空腸絨毛高度/隱窩深度顯著低于22日齡(P＜0.05)，隱窩深度顯著高于22日齡(P＜0.05);35日齡斷奶仔豬空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著高于22、24和28日齡(P＜0.05)。結(jié)果表明，2

8、1日齡斷奶使仔豬的腸形態(tài)發(fā)生了較大的變化，斷奶后1周仔豬腸形態(tài)損傷嚴重，28日齡后逐漸恢復，至35日齡腸形態(tài)基本恢復。
　　 2.與哺乳組相比，斷奶組血漿D-乳酸含量和二胺氧化酶活性在斷奶后不同時間均顯著提高(P＜0.05)。至35日齡時斷奶組血漿D-乳酸和二胺氧化酶雖不再提高，但是仍顯著高于哺乳組(P＜0.05)。與哺乳組相比，斷奶組空腸、結(jié)腸TER在斷奶后不同時間均顯著降低(P＜0.05)。但35日齡斷奶仔豬空腸、結(jié)腸TER

9、仍均顯著低于哺乳組(P＜0.05)。與血漿D-乳酸含量和二胺氧化酶活性的結(jié)果一致，表明腸道通透性在35日齡時還未完全恢復，而仔豬斷奶后造成腸形態(tài)的損傷在35日齡基本恢復，說明腸屏障功能的恢復滯后于腸形態(tài)的重建。
　　 3.哺乳仔豬空腸黏膜上皮細胞表面微絨毛排列整齊，腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接致密。斷奶仔豬空腸上皮微絨毛稀疏、排列不整，部分脫落，緊密連接疏松、間隙增寬、密度降低。斷奶后仔豬腸上皮緊密連接蛋白ZO-1、occlud

10、in在斷奶后24日齡的含量達到最低值，28日齡后逐漸升高。
　　 4.斷奶初期促炎細胞因子急劇上升，斷奶后1天促炎因子的含量達到高峰，說明仔豬的免疫系統(tǒng)被迅速而且高度激活，腸道產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。但斷奶一周以后促炎因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ顯著降低(P＜0.05)，與哺乳組相比差異不顯著(P＞0.05); IL-6含量雖然在斷奶一周以后顯著降低(P＜0.05)，但仍顯著高于哺乳組(P＜0.05)。
　　 5.斷奶應(yīng)

11、激顯著增加了p38 MAPK磷酸化與總水平的比值p-p38 MAPK/p38MAPK、(P＜0.05)，斷奶仔豬24日齡p-p38 MAPK/p38 MAPK達到高峰，說明仔豬斷奶應(yīng)激激活了p38 MAPK，但隨后磷酸化比值隨著日齡的延長逐漸降低。
　　 6.斷奶組空腸和結(jié)腸TER顯著低于哺乳組(P＜0.05)，進一步表明斷奶應(yīng)激使仔豬腸道通透性增加，腸屏障功能受損。與斷奶組相比，p38 MAPK抑制劑組空腸和結(jié)腸TER顯著增加

12、(P＜0.05)，但仍顯著低于哺乳組(P＜0.05)。
　　 7.p38抑制劑預處理仔豬空腸黏膜各促炎因子水平以及結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平顯著低于斷奶組(P＜0.05); p38抑制劑組各促炎因子水平顯著高于哺乳組(P＞0.05)。
　　 試驗結(jié)果表明:
　　 斷奶應(yīng)激使仔豬腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)疏松，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達降低，腸上皮屏障受到持續(xù)的損傷，腸屏障功能的恢復