雄激素在腎結(jié)石形成過(guò)程中作用的研究.pdf

1、尿石癥是泌尿外科的最常見的疾病之一，而男性結(jié)石的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性，以前對(duì)結(jié)石發(fā)病機(jī)制的研究多集中在動(dòng)物模型中雄激素對(duì)尿液成分的影響與結(jié)石形成的關(guān)系，即尿液中草酸等促進(jìn)結(jié)石成分的過(guò)飽和以及骨橋蛋白，枸櫞酸等抑制結(jié)石形成的成分的減少，而近年發(fā)現(xiàn)僅有尿液中結(jié)石成分過(guò)飽和、抑制結(jié)石成分的下降是很難形成腎結(jié)石的，腎小管上皮細(xì)胞在腎結(jié)石產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮了十分重要的作用，事實(shí)上，只有結(jié)晶粘附于腎小管上皮細(xì)胞上才能繼續(xù)生長(zhǎng)，變成有臨床癥狀的結(jié)石。但是

2、雄激素在腎結(jié)石患者腎小管上皮細(xì)胞的作用方面，目前極少有研究涉及，而這方面的研究，能更好的闡釋腎結(jié)石發(fā)病的性別差異的問(wèn)題，能為腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制的研究提供新的研究思路和方向。
　　 目的:
　　 1、探討雄激素是否為腎結(jié)石的誘發(fā)因素之一，即雄激素是否促進(jìn)了腎結(jié)石的產(chǎn)程。
　　 2、探討雄激素促進(jìn)腎結(jié)石產(chǎn)生的機(jī)制，即雄激素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。
　　 內(nèi)容:
　　 1、選取接受經(jīng)皮腎鏡檢查

3、碎石手術(shù)(PCNL術(shù))的成年男性患者，和體檢合格的正常男性患者，留取患者血漿標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)患者睪酮和游離睪酮水平；并于手術(shù)結(jié)束時(shí)超聲引導(dǎo)下穿刺獲得腎小管上皮組織；術(shù)后留取患者結(jié)石成分，采用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜測(cè)定結(jié)石成分。然后采用正常腎組織作為對(duì)照，采用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)石患者腎小管上皮組織的雄激素受體表達(dá)情況以及叢生蛋白的表達(dá)情況，比較二者表達(dá)與各自對(duì)照組有無(wú)差別。
　　 2、培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基

4、中加入不同終濃度的睪酮(1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM)以及雄激素拮抗劑氟他胺(100 nM)，分別作用6小時(shí)，24小時(shí)和72小時(shí)，然后采用MTT法檢測(cè)睪酮對(duì)HK-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況，再采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。
　　 3、檢測(cè)上述條件下睪酮及雄激素受體拮抗劑處理過(guò)的HK-2細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白叢生蛋白的表達(dá)情況并比較其兩種亞型分泌型(s-clusterin)和細(xì)胞核型(n-clusterin)表達(dá)

5、的差別，采用RT-PCR方法和Western-blotting方法檢測(cè)上述二者在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的差異，了解他們?cè)诓G酮誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、所有男性結(jié)石患者術(shù)后結(jié)石紅外光譜測(cè)定結(jié)石成分，均以草酸鈣成分為主，包括一水草酸鈣和二水草酸鈣。所有入選對(duì)象ELISA法檢測(cè)血睪酮和游離睪酮結(jié)果表明，腎結(jié)石患者的血睪酮和游離睪酮水平均高于正常對(duì)照人群(P＜0.01)，而且血睪酮

6、和游離睪酮二者具有明顯的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。免疫組化研究結(jié)果表明，腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核雄激素受體表達(dá)陽(yáng)性，近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管均有表達(dá)，以近曲小管、遠(yuǎn)曲小管為主，而且結(jié)石患者腎組織表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)；同樣，免疫組化結(jié)果表明，在腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿中叢生蛋白表達(dá)陽(yáng)性，結(jié)石患者的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 2、體外HK-2細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，睪酮能抑制細(xì)胞增殖，MTT法檢測(cè)細(xì)

7、胞生長(zhǎng)抑制曲線，表明隨著睪酮濃度的增高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，睪酮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制明顯升高(P＜0.01)，最大的抑制率為1000nM，作用72小時(shí)；其次睪酮能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，經(jīng)過(guò)睪酮處理的HK-2細(xì)胞的凋亡百分率明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，而且同樣隨著睪酮濃度的升高、處理時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率明顯升高，并且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、檢測(cè)經(jīng)睪酮處理過(guò)的HK-2細(xì)胞叢生蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)睪酮處理過(guò)以后，采

8、用RT-PCR方法檢測(cè)mRNA表達(dá)、采用western-blotting法檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)s-clusterin蛋白表達(dá)下降，而n-clusterin蛋白表達(dá)升高，二者共同作用參與了HK-2細(xì)胞的凋亡過(guò)程。
　　 結(jié)論:
　　 1、男性腎結(jié)石患者的血總睪酮水平、游離睪酮水平均明顯高于正常對(duì)照組，腎結(jié)石腎組織的雄激素受體表達(dá)明顯高于正常對(duì)照，所以推測(cè)雄激素在腎臟草酸鈣結(jié)石產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，在全身循環(huán)代

9、謝和腎臟腎小管上皮細(xì)胞都產(chǎn)生影響，促進(jìn)了腎結(jié)石的產(chǎn)生。
　　 2、睪酮能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)，因此這種對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的作用很可能是其參與腎結(jié)石形成的途徑之一。
　　 3、經(jīng)睪酮處理后腎小管上皮細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果表明clusterin的mRNA水平升高，western-blotting方法檢測(cè)結(jié)果表明N-clusterin的蛋白水平升高，而S-cluster