候選基因LBC在雞精原干細胞形成過程中的作用研究.pdf

1、精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性成體干細胞中唯一一種能夠將遺傳物質傳遞給下一代的干細胞。SSCs作為生殖干細胞，是精子發(fā)生的基礎，在研究精子發(fā)生機制、闡述男性不育病因和治療男性不育癥等領域有著不可替代的作用。精原干細胞的形成受到相關基因的調控，但是其具體分子機制現(xiàn)在仍然未知。本研究針對精原干細胞上特異表達候選基因LBC進行功能驗證，以如皋黃雞作為試驗動物，在體外和體內通過敲除和過表達LBC

2、基因的方法，研究LBC基因在雞精原干細胞形成過程中的作用，為闡明精原干細胞發(fā)生及分化機制提供參考。
　　本文主要研究如下:
　　1.如皋黃雞LBC基因的克隆根據NCBI提供的LBC基因序列，設計引物克隆LBC基因的CDS區(qū)，并將其連接至pMD19-T載體中進行測序。測序結果表明pMD19-T-LBC構建正確，與公布的原雞LBC基因CDS區(qū)同源性達99.43％，編碼氨基酸有兩個發(fā)生改變，成功克隆出如皋黃雞中LBC基因，可用于后

3、續(xù)研究。
　　2.LBC基因多克隆抗體制備及亞細胞定位研究制備LBC基因的抗原多肽，注射小鼠進行免疫，收集血清后通過間接免疫熒光技術(IFA)進行抗體效價檢測;構建真核表達載體pEGFP-N1-LBC，轉染DF-1細胞48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉染結果，并利用RT-PCR和間接免疫熒光試驗進一步鑒定LBC-eGFP mRNA和蛋白水平的表達狀況。結果發(fā)現(xiàn)，RT-PCR能檢測到融合蛋白轉錄水平的表達，熒光顯微鏡觀察和IFA檢測

4、結果都顯示LBC-eGFP融合蛋白在細胞核和細胞質中都有表達，與生物信息學預測結果相一致。
　　3.LBC基因對精原干細胞形成的影響構建LBC敲除載體CRISPR/Cas9-LBC和過表達載體pcDNA3.0-LBC，轉染DF-1細胞后利用測序、T7E1酶切和Western Blot技術驗證載體活性;分別轉染ESC，在RA誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用形態(tài)學觀察、免疫化學檢測和QRT-PCR等方法在體外檢測LBC缺失與過表達對ESC向SS

5、C分化的影響，同時雞胚注射CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.O-LBC載體，采用石蠟切片和流式分析的方法在體內檢測LBC缺失與過表達對PGCs和SSCs形成的影響。結果表明CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.0-LBC載體均構建成功且具有活性;體外實驗中，與RA誘導組相比，LBC過表達顯著地促進了ESC向SSC的分化，且integrinα6、integrinβ1等SSCs標記基因的表達量也有顯著的增加，在第10天，

6、相對于誘導組中integrinα6的相對表達量(1.96)，在過表達組中達到2.34;相反的，LBC敲除，ESCs向SSCs的分化受到一定程度的抑制，第6天克隆形成之后，不能形成精原樣細胞，且全能性標記基因Sox2的表達量的降低受到抑制，相對于誘導組中相對表達量(0.96)，在敲除組中達到1.03，integrinα6、integrinβ1表達量也相對減少;體內試驗中，與正常發(fā)育的雞胚相比，LBC過表達顯著的促進了PGC和SSC細胞的生