維A酸信號(hào)通路中RA及膜受體STRA6與Nitrofen誘導(dǎo)的CDH肺發(fā)育不良的關(guān)系研究.pdf

1、目的: 1．探討全反式維生素A（RA）對(duì)Nitrofen誘導(dǎo)的先滅性膈疝大鼠胎肺體外培養(yǎng)模型的影響，研究RA對(duì)CDH肺發(fā)育不良的作用。 2．探討STRA6在正常妊娠大鼠胎肺發(fā)育過程中的表達(dá)特點(diǎn)和作用。 3．探討STRA6在Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠模型胎肺發(fā)育過程中表達(dá)特點(diǎn)和作用。 方法: 1．動(dòng)物模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組:成年SPF級(jí)SD雌性大鼠24只，編號(hào)后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組和Ni

2、trofen誘導(dǎo)組，將雌性與雄性SD大鼠合籠過夜，翌日陰道涂片鏡下檢及精子視為妊娠，當(dāng)天上午定為妊娠第0．5天，雌鼠受孕后第13．5、15．5天對(duì)照組和Nitrofen誘導(dǎo)組各分配2只孕鼠，第17．5，21．5天對(duì)照組和Nitrofen誘導(dǎo)組各分配4只孕鼠；Nitrofen誘導(dǎo)組大鼠于妊娠第9．5天、在乙醚吸入淺麻醉下經(jīng)胃管注入Nitrofen100mg（溶于橄欖油，濃度100mg/ml），對(duì)照組大鼠僅注入1ml橄欖油。兩組分別于妊娠第

3、13．5天、15．5天、17．5天、21．5天在麻醉下行剖宮產(chǎn)取出胎鼠，解剖后取左肺胎肺進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。第13．5天胎肺用于器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，按孕鼠是否灌入Nitrofen和是否在培養(yǎng)基中添加外源性RA分為四組：對(duì)照組（n=6），對(duì)照+RA組（n=6），Nitrofen組（n=6），Nitrofen+RA組（n=6）；第15．5天全部胎肺，第17．5天和第21．5天部分胎肺用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，按孕鼠是否灌入Nitrofen分為兩組：Ni

4、trofen誘導(dǎo)組（n=18）和對(duì)照組（n=18）；第17．5天和第21．5天部分胎肺用于免疫熒光組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，分為兩組：Nitrofen誘導(dǎo)組（n=12）和對(duì)照組（n=12）。 2．器官培養(yǎng)的方法研究RA對(duì)Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺體外培養(yǎng)模型的影響:第13．5天時(shí)剖宮產(chǎn)取出胎鼠后，HBSS清洗三次，在NIKON SMZ-1000體視顯微鏡下取出胎鼠左肺胚芽后放置在12孔TRANSWELL板上，在下層加入DMEM

5、-F12無血清培養(yǎng)基或含RA的培養(yǎng)基。放入37度含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時(shí)，每24小時(shí)更換培養(yǎng)液，在顯微鏡下觀察生長情況并記錄圖像。對(duì)照+RA組，Nitrofen+RA組在培養(yǎng)基中添加含1umol/l RA的無水乙醇于DMEM-F12無血清培養(yǎng)基中，終濃度為0．4％。用Image-pro plus version6．0圖像分析軟件對(duì)肺發(fā)育參數(shù)肺面積和周長進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）方法檢測(cè)STRA6

6、mRNA在Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺中的表達(dá):Trizol法提取胎肺標(biāo)本總RNA，核酸定量儀檢測(cè)各標(biāo)本總RNA濃度，并用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。采用兩步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Taqman探針法）技術(shù)檢測(cè)各標(biāo)本中STRA6和管家基因β-actin mRNA的濃度（每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)復(fù)管，由相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出濃度），然后分別經(jīng)過管家基因校正和參照組樣本校正得出各胎肺標(biāo)本中STRA6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

7、 4．免疫熒光組織化學(xué)（IMF）方法檢測(cè)STRA6蛋白在itrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺的表達(dá):采用免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)STRA6蛋白在對(duì)照組和Nitrofen誘導(dǎo)組第17．5天、第21．5天的表達(dá)情況，計(jì)算免疫熒光數(shù)量。 結(jié)果: 1．Nitrofen誘導(dǎo)的CDH大鼠模型的構(gòu)建 對(duì)照組的12只孕鼠經(jīng)剖宮產(chǎn)得到胎鼠85只；Nitrofen誘導(dǎo)組第13．5天和第15．5天4只孕鼠共得到胎鼠30只，第17．5

8、天和第21．5天8只孕鼠共得到胎鼠61只，其中膈疝共28只，占45．9％（28/61）。膈疝均為左側(cè)的后外側(cè)巨大膈疝，疝入的腹腔臟器主要為肝臟和胃，小腸和脾臟也有疝入。解剖膈疝胎鼠胸腔后可見雙肺均縮小，與對(duì)照組相比左側(cè)肺變小更明顯。 2．組織學(xué)檢查 對(duì)照組大鼠肺發(fā)育較為成熟，而在Nitrofen誘導(dǎo)組的胎鼠肺發(fā)育明顯滯后，支氣管分支減少，大部分肺泡塌陷，肺泡間隔彌漫性的增寬，肺泡管、肺泡及肺泡囊呈假腺體樣改變。小動(dòng)脈肌層

9、增厚，平滑肌細(xì)胞增生。部分小動(dòng)脈可見平滑肌異常分布。 3．RA對(duì)Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺體外培養(yǎng)模型的影響 形態(tài)學(xué)結(jié)果：對(duì)照組和對(duì)照+RA組肺胚芽發(fā)育明顯比Nitrofen組和Nitrofen+RA組成熟，培養(yǎng)96小時(shí)后，可見胚芽發(fā)育并增殖；Nitrofen組肺胚芽發(fā)育差，培養(yǎng)72小時(shí)后肺胚芽逐漸出現(xiàn)發(fā)育停止和壞死的情況；Nitrofen+RA組肺胚芽發(fā)育明顯改善。發(fā)育參數(shù)結(jié)果：培養(yǎng)96小時(shí)后，對(duì)照組與對(duì)

10、照+RA組相比，肺面積（2．535±0．423 m㎡ vs2．088±0．622 m㎡）及周長（6．544±0．710mm vs6．593±1．133 mm）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Nitrofen+RA組的肺面積比Nitrofen組（1．867±0．032 m㎡vs1．053±0．033 m㎡）明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，周長（6．237±0．581 mm vs4．862±0．458mm）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組和對(duì)照+RA組分別與Nitrofen組相

11、比，肺面積及周長均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．QPCR檢測(cè)STRA6 mRNA在Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺中的表達(dá) 對(duì)照組：STRA6 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量分別為14．800±5．155，4．061±2．765，1．000±0．449，第15．5天與第17．5天和第21．5天相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Nitrofen組：STRA6 mRNA相對(duì)表達(dá)量波動(dòng)，各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量分別為1．191±0．

12、351，7．552±3．716，0．951±0．942，D17．5天表達(dá)升高，第17．5天與第15．5天和第21．5天相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第15．5天，對(duì)照組與Nitrofen誘導(dǎo)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5．免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)STRA6蛋白在Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺中的表達(dá) 第17．5天對(duì)照組與Nitrofen誘導(dǎo)組免疫熒光數(shù)量分別為809．500±82．243、1471．167±228．687，兩組相比

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1．在第13．5天，肺發(fā)育早期，對(duì)照組與對(duì)照+RA組肺胚芽發(fā)育明顯比Nitrofen組和Nitrofen+RA組成熟，這表明Nitrofen在胚胎發(fā)育早期就導(dǎo)致肺發(fā)育不良。 2．外源性添加RA培養(yǎng)96小時(shí)后，RA能明顯改善Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎肺體外培養(yǎng)模型的肺胚芽面積．這表明RA能明顯改善Nitrofen誘導(dǎo)的CDH肺發(fā)育不良。 3．在第15．5天，肺發(fā)育早期，N

14、itrofen誘導(dǎo)組sTRA6 mRNA相對(duì)表達(dá)量水平比對(duì)照組顯著降低，結(jié)合STRA6的生物學(xué)功能：轉(zhuǎn)運(yùn)Vit A和調(diào)節(jié)細(xì)胞吸收Vit A，我們推測(cè)Nitrofen能誘導(dǎo)CDH肺發(fā)育不良的發(fā)生的原因，可能是干擾肺細(xì)胞表面RBP受體STRA6的表達(dá)，導(dǎo)致肺細(xì)胞吸收Vit A障礙所致。 4．在第17．5天，肺發(fā)育中期，Nitrofen誘導(dǎo)組STRA6蛋白熒光數(shù)目比對(duì)照組顯著升高，STRA6 mRNA相對(duì)表達(dá)量水平升高，這可能是維A酸