大鼠睪丸移植模型的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶表達研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定，夫婦同居1年以上，未采用任何避孕措施，由于男方因素造成女方不孕者，稱為男性不育。據(jù)統(tǒng)計，世界發(fā)達國家5％～8％的育齡夫婦可能存在不育問題，而發(fā)展中國家的某些地區(qū)可高達30％。在我國，不育癥發(fā)病率也在逐步上升，北京協(xié)和醫(yī)院男科將1980～1990年問診治的萬余例男性不育者進行了粗略統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)就診人數(shù)后5年是前5年的2倍多。男性生殖健康狀況令人擔(dān)憂。 引起男性不育的因素有很多。睪丸移植是治療無睪癥和雙側(cè)小

2、睪癥伴嚴(yán)重低睪酮血癥的可選擇的重要方法之一。目前，睪丸移植的臨床研究僅限于經(jīng)典的器官移植。而同種異體睪丸移植由于術(shù)后生精功能恢復(fù)不良等原因，發(fā)展受到很大限制。為此，眾多研究嘗試通過睪丸移植動物模型探索移植睪丸損傷的機制，尋找保護移植睪丸生精功能的方法。 睪丸移植動物模型早年采用大型動物如犬類等，獲得一定效果。但由于大型動物費用昂貴，麻醉要求高及難于飼養(yǎng)管理等因素，推廣受到限制。1971年Lee等建立大鼠睪丸移植模型，為睪丸移植研

3、究創(chuàng)造了有利條件。但由于小型動物血管吻合難度高，發(fā)展緩慢。2003年，譚付清等利用cuff管法成功進行大鼠異體睪丸移植，進一步推動了睪丸移植研究發(fā)展。但由于大鼠睪丸血管變異較多，因此，應(yīng)區(qū)別對待方有助于該模型的進一步推廣應(yīng)用。我們通過100例研究，共發(fā)現(xiàn)大鼠四種左側(cè)睪丸血管走向類型，第一種：左睪丸動脈來自腹主動脈，左睪丸精索靜脈匯入左髂總靜脈者，即譚付清等報道的類型，約占63％；第二種：左睪丸動脈來自左腎動脈，而左睪丸精索靜脈匯入左髂總

4、靜脈者，約占13％；第三種：左睪丸動脈來自左腎動脈，而左靜脈匯入左腎靜脈者，約占14％：第四種：左睪丸動脈匯入腹主動脈，而左睪丸精索靜脈匯入左腎靜脈者，約占10％。因此有必要針對不同左睪丸血管走向類型對手術(shù)方法做相應(yīng)的調(diào)整。在移植睪丸損傷機制的研究領(lǐng)域中，缺血再灌注損傷備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)ERK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶)在缺血再灌注模型中被激活并介導(dǎo)靶器官組織的損傷。但也有研究持不同觀點。睪丸移植是否激活ERK表達，ERK與移植睪丸損傷的關(guān)

5、系如何，目前仍不清楚。 我們的研究應(yīng)用譚付清等報道的方法建立大鼠睪丸原位異體睪丸移植模型，并進行改良，擴大原模型的適用范圍；并在此基礎(chǔ)上，研究大鼠睪丸移植模型中ERKl(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1)、ERK2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2)、pERKl(磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1)和pERK2(磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2)表達水平變化，探討ERK表達水平與移植睪丸損傷的關(guān)系，同時觀察MEK1／2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激酶1／2)抑制劑U012

6、6(C18 H16 N6 S2)對ERK1、ERK2、pERK1和pERK2表達水平的影響，及其在短期內(nèi)(一周及一個月)對移植睪丸的保護作用。 第一部分:大鼠原位異體睪丸移植模型的建立與改良 目的:采用2003年譚付清等報道的大鼠原位異體睪丸移植模型進行大鼠睪丸移植，并對此模型進行改良，擴大該模型應(yīng)用范圍，為睪丸移植相關(guān)基礎(chǔ)研究提供穩(wěn)定的平臺。 方法:實驗動物為230～250g體重Lewis大鼠。根據(jù)解剖發(fā)現(xiàn)的四

7、種不同的大鼠左睪丸血管走向類型，設(shè)計相應(yīng)的供體血管切取方法及移植時血管吻合方法，建立并改良大鼠睪丸移植模型。開放血流后移植睪丸恢復(fù)正常顏色和輸精管末端有活動性出血為移植成功的判斷標(biāo)志。比較四種手術(shù)方法間平均手術(shù)時間、平均冷缺血時間、平均血管吻合時間、即時血流通暢率的差異，及術(shù)后一周移植睪丸血供和受體左下肢血供情況。 結(jié)果: 1.四種手術(shù)方法即時血流通暢率均為100％，組間無差異。2.四種手術(shù)方法在平均總手術(shù)時間、平均冷缺

8、血時間及平均血管吻合時間有所差異。 3.四種手術(shù)方法術(shù)后1周解剖時發(fā)現(xiàn)血供情況均良好，睪丸動脈搏動正常，睪丸色澤紅；各組左下肢體溫同右下肢，活動無障礙，提示血供良好。 結(jié)論: 1.本部分成功建立大鼠原位異體睪丸移植模型并進行改良。 2.四種手術(shù)方法間手術(shù)時間的差別不影響改良組的即時血流通暢率。 3.結(jié)扎受體左髂總靜脈不影響受體左下肢血液循環(huán)。 4.切除受鼠一個腎臟，不影響睪丸移植模型的建立。

9、 第二部分:睪丸移植對ERK1、ERK2、pERK1及pERK2表達水平的影響 目的:測定睪丸移植供睪ERK1、ERK2、pERK1及pERK2表達水平的變化，并分析其上述酶表達水平變化與供睪形態(tài)學(xué)損傷的關(guān)系。 方法:將實驗大鼠分為4組：①正常對照組，②冷缺血組，③假手術(shù)組，和④睪丸移植組。Westem-Blot法測定各組移植睪丸ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達水平，光鏡和電鏡下觀察組織學(xué)改變并計算平均

10、睪丸活檢評分(MTBS)。ERK1與ERK2表達灰度值和內(nèi)參照表達灰度值的比值，作為ERK1與ERK2表達水平測定值；pERK1與pERX2表達灰度值和內(nèi)參照表達灰度值的比值，作為pERK1與pERK2表達水平測定值；并分別計算pERK1／ERK1比值和pERK2／ERK2比值。比較各組ERK1、ERK2、pERK1、pERK2的表達水平及pERK1／ERK1比值和pERK2／ERK2比值的差異。 結(jié)果: 1.正常對照組

11、、冷缺血組和假手術(shù)組ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達水平均無顯著性差異。 2.正常對照組、冷缺血組和假手術(shù)組移植睪丸光鏡及電鏡下形態(tài)近似，MTBS無明顯差異。 3.睪丸移植組ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達水平均明顯高于正常對照組，但pERK1／ERK1比值及pERK2/ERK2比值與正常對照組無明顯差異。 4.睪丸移植1組的形態(tài)學(xué)改變較正常對照組明顯，MTBS低于正常對照組。

12、 結(jié)論: 1.一般手術(shù)操作及冷缺血過程不影響ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達水平，對移植睪丸不產(chǎn)生顯著形態(tài)學(xué)損傷。 2.睪丸移植缺血再灌注過程分別激活ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達，并且成比例增長，故pERK1／ERK1的比值及pERK2／ERK2的比值并沒有增加。 3.睪丸移植缺血再灌注過程造成的形態(tài)學(xué)損傷，與ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達水平呈正相關(guān)。

13、 第三部分:MEK抑制劑U0126在短期內(nèi)對移植睪丸生精功能的保護作用 目的:研究睪丸移植后短期內(nèi)，移植睪丸生精功能變化，及U0126預(yù)處理在短期內(nèi)對移植睪丸生精功能的影響。 方法:設(shè)立二組：睪丸移植組、睪丸移植U0126預(yù)處理組；手術(shù)組各分三個時點進行觀測：移植后30min、一周及一個月。Western-Blot法測定30min時點移植睪丸ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表達水平。應(yīng)用放射免疫試劑盒檢

14、測受體血清T、FSH和LH水平，光鏡及電鏡下觀察移植睪丸形態(tài)學(xué)變化并進行Johnsen評分，測量并計算睪丸移植前后體積縮小百分比。比較各組實驗結(jié)果之間的差異。 結(jié)果: 1.術(shù)后一個月內(nèi)，睪丸移植組睪丸體積逐漸縮小，形態(tài)學(xué)損傷逐漸加重，MTBS及血清睪酮水平逐漸下降。 2.U0126預(yù)處理組ERK1、ERK2表達水平與睪丸移植組無顯著差異，pERK1、pERK2表達水平顯著低于睪丸移植組，且pERK2下降更顯著。

15、 3.移植后30min，U0126預(yù)處理組形態(tài)學(xué)改變顯著輕于睪丸移植組，MTBS高于睪丸移植組。 4.術(shù)后一周，UOl26預(yù)處理組大鼠血清T、LH、FSH水平較睪丸移植組均顯著升高，但較正常對照組均無顯著性差異；移植睪丸形態(tài)學(xué)改變較睪丸移植組輕；MTBS較睪丸移植組高；睪丸體積縮小百分比較睪丸移植組低。 5.術(shù)后一個月，U0126預(yù)處理組僅睪丸體積縮小百分比低于睪丸移植組，其余結(jié)果均與睪丸移植組無差異。 結(jié)

16、論: 1 移植睪丸在術(shù)后一個月內(nèi)，隨時間延長，形態(tài)學(xué)損傷逐漸加重，生精功能逐漸下降。 2 UOl26不影響ERK1與ERK2的合成，但能明顯抑制ERK1與ERK2的磷酸化，且對ERK2磷酸化的抑制效果強于ERK1。 3 U0126預(yù)處理通過抑制ERK1及ERK2磷酸化，在術(shù)后一周內(nèi)顯著減輕移植睪丸的形態(tài)學(xué)損傷，并維持生殖激素水平，保護生精功能。 4 U0126預(yù)處理在術(shù)后一個月僅能延緩移植睪丸的萎縮，而無