Il-8及Il-8R抗體抑制雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的研究.pdf

1、目的：
　　本課題首先通過實驗驗證DU145細(xì)胞能高表達(dá)IL-8;然后，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)、MTT法、Transwell試驗及免疫熒光實驗探討IL-8抗體和IL-8R抗體能加速DU145細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖和遷移，為臨床應(yīng)用IL-8抗體和IL-8R抗體治療雄激素非依賴性PCa提供新的靶點和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.DU145細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8水平的檢測:分別取DU145細(xì)胞培養(yǎng)0h、12h、24h和48h上

2、清500ul，分為0h組（即為對照組）、12h組、24h組和48h組四個組，采用IL-8ELISA檢測試劑盒，檢測不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)上清IL-8含量。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測DU145細(xì)胞凋亡:選取DU145細(xì)胞鋪板，每孔1ml，細(xì)胞濃度5×105/ml，分別加入IL-8抗體，IL-8R抗體及加入等量培養(yǎng)基作為對照組，即anti-IL-8組、anti-IL-8R組和Control組。24h后分別檢測三組腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
　　

3、3.MTT法檢測DU145細(xì)胞增殖活性:應(yīng)用MTT法分別檢測anti-IL-8組、anti-IL-8R組和Control組腫瘤細(xì)胞增殖情況。
　　4.Transwell試驗檢測DU145細(xì)胞遷移能力:應(yīng)用Transwell試驗分別檢測anti-IL-8組、anti-IL-8R組和Control組腫瘤細(xì)胞穿過生物膜形成克隆數(shù)多少。
　　5.免疫熒光結(jié)核激光共聚焦顯微鏡檢測DU145細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá):應(yīng)用免疫熒光結(jié)核激光共

4、聚焦顯微鏡檢測分別檢測anti-IL-8組、anti-IL-8R組和Control組腫瘤細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)量。
　　6.統(tǒng)計學(xué)方法:計量數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組間差異比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.酶聯(lián)免疫法ELISA檢測IL-8濃度:0h組、12h組、24h組和48h組DU145細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8濃度分別為(0.03±0.02)ng

5、/ml、（1.21±0.05）ng/ml、（3.10±0.05）ng/ml、（3.91±0.06）ng/ml。各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（均有P＜0.001）。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測DU145細(xì)胞凋亡率:結(jié)果顯示與空白對照組相比，DU145細(xì)胞經(jīng)IL-8/IL-8R刺激后凋亡率分別為（9.92±1.02）％和（10.34±1.07）％，均比空白對照組(1.60±0.37)％，且有統(tǒng)計學(xué)差異（T=21.2，P＜0.001;T=12.5

6、，P＜0.001）。
　　3.MTT法檢測DU145細(xì)胞增殖活性:加入IL-8抗體和IL-8R抗體后DU145細(xì)胞克隆形成減少，分別為（1.31±0.10）和（1.07±0.14），兩組OD值均顯著低于空白對照組（3.02±0.08），且有統(tǒng)計學(xué)差異（T=9.3，P＜0.001;T=5.4，P＜0.001）。
　　4.Transwell檢測DU145細(xì)胞遷移能力:加入IL-8抗體組或IL-8R抗體組細(xì)胞穿過生物膜形成克隆數(shù)分

7、別為（49.67±3.54）個、(49.83±3.44)個，均低于未加抗體的空白對照組克隆個數(shù)（164.83±4.63）個，且有統(tǒng)計學(xué)差異(T=19.3，P＜0.001;T=9.3，P＜0.001)。
　　5.免疫熒光檢測DU145細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá):未加抗體的空白對照組細(xì)胞呈現(xiàn)梭形較多，胞質(zhì)豐富，HMGB1表現(xiàn)為紅色大顆粒狀或小塊狀。而加入IL-8/IL-8R抗體后，細(xì)胞多呈現(xiàn)圓形，胞質(zhì)減少，HMGB1表達(dá)信號弱，僅呈現(xiàn)微粒