降鈣素基因相關(guān)肽誘導前軟骨干細胞增殖和成骨分化的實驗研究.pdf

1、第一部分 CGRP對前軟骨干細胞增殖的影響
　　目的：體外獲取并培養(yǎng)純化SD大鼠前軟骨干細胞（PSCs），為以后的實驗提供細胞來源。觀察不同濃度梯度的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在體外對前軟骨干細胞增殖的影響，為后續(xù)試驗確定合適的CGRP刺激濃度。
　　方法：
　　1.前軟骨干細胞的分離、純化和體外培養(yǎng)及鑒定：取出生24小時內(nèi)的SD大鼠乳鼠，
　　手術(shù)顯微鏡下環(huán)行切取La Croix環(huán)，體外培養(yǎng)細胞。磁性細胞分選

2、系統(tǒng)分離純化得到前軟骨干細胞，并且傳代、擴增。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)變化；
　　2.采用細胞免疫化學方法檢測，辣根過氧化物酶標記，DAB顯色，檢測細胞表面FGFR-3表達情況；
　　3.CCK-8法檢測干細胞的增殖：將純化后的第3代前軟骨干細胞置接種于96孔板中培養(yǎng)，加入濃度分別為0、10-8、10-9、10-10mol/L的CGRP刺激，于孵育的第0、3、7、10、14d按CCK-8試劑盒的要求測定吸光度，

3、繪生長曲線圖。比較不同濃度梯度的CGRP對前軟骨干細胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1.免疫磁珠分離純化后的前軟骨干細胞絕大部分呈三角形或多角形，透明，貼壁生長，折光性良好，核大且胞漿少，細胞形態(tài)及大小較為均一。細胞免疫化學檢測可見純化后的PSCs胞漿中FGFR-3抗體染色陽性；
　　2.對純化后的PCSCs計數(shù)進行細胞生長動力學分析后發(fā)現(xiàn)，在相同的時間點，不同濃度的CGRP組間比較沒有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)

4、論：
　　1.免疫磁珠分選法可以簡便而有效獲得純化的性狀穩(wěn)定的前軟骨干細胞，為以后的實驗提供了豐富的干細胞來源；
　　2.不同濃度的CGRP對體外培養(yǎng)的前軟骨干細胞的增殖沒有影響。
　　第二部分 CGRP對前軟骨干細胞成骨分化的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關(guān)肽在體外對前軟骨干細胞成骨標志性基因的RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I的表達，以及堿性磷酸酶活性和礦化化結(jié)節(jié)產(chǎn)生的影響。

5、　　方法：
　　1.分別以10-9mol/L和0mol/L的CGRP刺激在成骨培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)的實驗組和對照組的前軟骨干細胞；
　　2.培養(yǎng)至第14d，茜素紅染色。在倒置顯微鏡鏡下觀察實驗組和對照組礦化結(jié)節(jié)形成的情況并拍照。用圖像分析軟件分析所得圖片；
　　3.按堿性磷酸酶檢測試劑盒要求，分別在3、7、10、14d時檢測并比較對照組和實驗組的堿性磷酸酶的活性；
　　4.分別于成骨誘導培養(yǎng)的第7d、14d離心收集細

6、胞，RT-PCR檢測并比較對照組和實驗組成骨細胞相關(guān)基因RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I基因的表達。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)CGRP刺激的前軟骨干細胞，在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后茜素紅染色的結(jié)果與對照組相比，橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯增多，結(jié)節(jié)大。定量檢測結(jié)果顯示兩組間礦化結(jié)節(jié)的面積有顯著性差異；
　　2.兩組ALP含量測定，在培養(yǎng)第3d時，兩組間無顯著差異，7-14d時實驗組較對照組ALP含量呈

7、極顯著增加的趨勢；
　　3.RT-PCR檢測顯示7d和14d時成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I基因的表達均顯著增加。
　　結(jié)論：CGRP在體外可上調(diào)前軟骨干細胞成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I基因的表達，使礦化結(jié)節(jié)和堿性磷酸酶活性增加，誘導其向成骨分化。
　　第三部分 Wnt通路在CGRP誘導前軟骨干細胞成骨分化過程中的作用
　　目的：探

8、討經(jīng)典Wnt通路在CGRP誘導前軟骨干細胞成骨分化過程中的作用。
　　方法：
　　1.將第3代細胞接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)分為4組，分別為：0mol/L的CGRP+0mol/L的DKK-1；10-9mol/L的CGRP+0mol/L的DKK-1；0mol/L的CGRP+10-8mol/L的DKK-1；10-9mol/LCGRP+10-8mol/L的DKK-1。成骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)7d后，提取總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度；

9、>　　2.Western blot檢測各組的蛋白β-catenin的表達，使用圖形軟件分析；
　　3.RT-PCR檢測各組前軟骨干細胞成骨細胞相關(guān)基因Runx2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I基因的表達的變化。
　　結(jié)果：CRGP刺激前軟骨干細胞后明顯促進蛋白β-catenin表達。加入β-catenin抑制劑DKK-1后，β-catenin表達明顯降低，同時下調(diào)Runx2、OPN、BGP基因表達，但Coll