快速老化小鼠聽功能、耳蝸NGFR TrkA的增齡性變化以及NGF轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng).pdf

1、目的:探討快速老化小鼠聽覺功能、耳蝸組織中神經(jīng)生長因子受體酪氨酸激酶受體A(nerve growth factor receptor TrkA，NGFR TrkA)表達(dá)的增齡性變化以及NGF轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，為老年性耳聾發(fā)病的分子機(jī)制和基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:該研究選用3、5、7月齡的快速老化小鼠亞系8(SAMP8)作為觀察對(duì)象。采用聽覺誘發(fā)反應(yīng)儀檢測其8kHz短純音ABR閾值;應(yīng)用免疫組化染色檢測NGFRTrk

2、A在耳蝸組織中的表達(dá)情況，并應(yīng)用光密度檢測分析其增齡性變化特點(diǎn)。將欲轉(zhuǎn)染的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分為四組:A組為脂質(zhì)體2000包裹的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;B組為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組;C組為脂質(zhì)體包裹的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;D組為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組。按質(zhì)粒提取試劑盒說明提取含NGF重組質(zhì)粒的陽性克隆大腸桿菌，將提取的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ and XhoⅠ雙酶切鑒定后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000

3、轉(zhuǎn)染方法將含有人β-NGF神經(jīng)生長因子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中，于轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用4％多聚甲醛固定各組細(xì)胞并通過細(xì)胞免疫組化染色檢測NGF的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1、各組SAMP8小鼠聽性腦干反應(yīng)閾值(ABR)分別為:3月齡SAMP8小鼠:左耳為31.667±2.582，右耳為32.500±2.739;5月齡SAMP8小鼠:左耳為54.167±2.041，右耳為53.333±2.582;7月齡SAMP8小鼠:左耳為58

4、.333±2.582，右耳為58.333±2.582。5月齡與3月齡進(jìn)行比較P＜0.05，7月齡與5月齡進(jìn)行比較P＜0.05有顯著性差異。2、NGFRTrkA蛋白在不同月齡快速老化小鼠耳蝸組織中均有表達(dá)，且主要表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)外毛細(xì)胞的胞核和胞漿。各組小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TrkA免疫組化染色平均光密度值分別為:3月齡SAMP8小鼠:0.5262±0.0148;5月齡SAMP8小鼠:0.4758±0.0129;7月齡SAMP8小

5、鼠:0.4505±0.0148。5月齡與3月齡進(jìn)行比較P＜0.05，7月齡與5月齡進(jìn)行比較P＜0.05有顯著性差異。各組小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞TrkA免疫組化染色平均光密度值分別為:3月齡SAMP8小鼠:0.6311±0.0200;5月齡SAMP8小鼠:0.5487±0.0179;7月齡SAMP8小鼠:0.5183±0.0187。5月齡與3月齡進(jìn)行比較P＜0.05，7月齡與5月齡進(jìn)行比較P＜0.05有顯著性差異。3、各組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞胞漿均

6、可見棕黃色顆粒，且脂質(zhì)體2000包裹的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(A組)NGF表達(dá)明顯高于其他組，與其他組進(jìn)行比較P＜0.05有顯著性差異。
　　結(jié)論:NGFRTrkA蛋白的表達(dá)水平隨著快速老化小鼠聽覺功能增齡性減退而降低，說明NGFRTrkA可能與維持耳蝸的功能狀態(tài)有關(guān);采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法能將NGF重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并能在中表達(dá)，為應(yīng)用β-NGF修飾的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行耳蝸移植治療老年聾的