小鼠脾臟基質(zhì)和B淋巴細胞的增齡性變化及同種異基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植對其的影響.pdf

1、目的：
　　1.檢測BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)的增齡性變化，探討β-catenin信號分子在脾臟基質(zhì)老化中的作用。
　　2.檢測BALB/c小鼠脾臟B淋巴細胞比例、B淋巴細胞亞群比例和增殖、凋亡、周期相關(guān)基因mRNA表達水平的增齡性變化，探討基質(zhì)老化對B細胞老化的影響。
　　3.探索C57BL/6J小鼠來源的同種異基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植對BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)和B細胞老化的影響。
　　方法：
　　1.將雌

2、性BALB/c小鼠分別按照2-4月齡、8-10月齡和18-20月齡定義為青年組、中年組和老年組。蘇木精-伊紅染色觀察不同年齡組小鼠脾臟的組織學(xué)特征;天狼星紅染色檢測脾臟中膠原分布情況;免疫組織化學(xué)法檢測脾臟collagenⅠ、elastin、fibronectin的蛋白表達情況。
　　2.實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測不同年齡組BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)成分agrin、cogegeⅠα1、collegenⅢα

3、1、collegenⅣα1、collegenⅥα1、elastin、fibrillin1、fibronectin1、fibulin1、lamininα5、MMP-2的mRNA表達水平，β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子DVL2、DVL3、CK1、GSK-3β，下游轉(zhuǎn)錄子TCF4，靶基因PPARδ、Axin2、c-myc、cyclin D1的mRNA相對表達量，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測β-catenin和CK1的

4、蛋白表達情況，Real-time PCR法檢測B細胞標記CD19的mRNA相對表達量。
　　3.制備脾臟單細胞懸液，流式細胞術(shù)檢測不同年齡組BALB/c小鼠脾臟CD19+B淋巴細胞比例及B細胞中CD19+ CD5+、CD19+ CD24+、CD19+IgM+IgD-和CD19+IgD+細胞亞群的比例。
　　4.流式細胞術(shù)分選、收集脾臟B淋巴細胞，Real-time PCR法檢測B細胞中增殖相關(guān)基因Ki-67，凋亡相關(guān)基因Ba

5、x、Bcl-2、Caspase3、Caspase8，細胞周期相關(guān)基因cyclinD1、cyclinE1、p16INK4a，抗原決定簇分子CD5、CD24，β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子DVL2、DVL3、CK1、GSK-3β，下游轉(zhuǎn)錄子TCF4，靶基因PPARδ、Axin2、c-myc的mRNA相對表達量。
　　5.骨片消化法分離、培養(yǎng)C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)。
　　6.通過尾靜脈向?qū)嶒灲M

6、小鼠體內(nèi)注射BMSCs，每2周注射一次，連續(xù)注射4次，單次注射量1×106個細胞（懸于100μl PBS），末次注射后2周取材，重復(fù)檢測上述脾臟基質(zhì)和B細胞老化相關(guān)指標的變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.老年組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，含鐵血黃素顆粒和Ⅰ型膠原沉積較青年組增加。
　　2.老年組小鼠脾臟基質(zhì)成分agrin、collagenⅠα1、collagenⅢⅢα1、collagenⅣα1、elastin和

7、fibrillin1的mRNA相對表達量顯著低于青年組小鼠(P＜0.01或P＜0.05);collagenⅥα1、fibronectin1、fibulin1、lamininα5和MMP2的mRNA相對表達量與青年組小鼠無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.老年組小鼠脾臟β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子CK1的mRNA和蛋白表達水平均低于青年組（P＜0.05或P＜0.01），下游靶基因PPARδ、cyclin D1、CD44的mRNA表達

8、水平顯著低于青年組（P＜0.01或P＜0.05）;其他調(diào)控子DVL2、DVL3、GSK-3β，下游轉(zhuǎn)錄子TCF4，靶基因Axin2的mRNA相對表達量均值低于青年組，但未達到統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.經(jīng)過4次C57BL/6J小鼠來源的同種異基因BMSCs移植后，老年組BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)成分collagenⅢα1的mRNA表達顯著上調(diào)(P＜0.01)，collagenⅣα1和fibronectin1的mRNA表達下

9、調(diào)(P＜0.05和P＜0.01);β-catenin信號分子的下游轉(zhuǎn)錄子TCF4和靶基因CD44 mRNA表達上調(diào)(P＜0.05)，其余相關(guān)基因表達無明顯變化。
　　第二部分
　　1.不同年齡組BALB/c小鼠脾臟中B淋巴細胞比例無顯著差異，老年組小鼠脾臟B細胞中CD19+ CD5+、CD19+ IgD+細胞亞群比例顯著高于青年組(P＜0.01)，CD19+ CD24+、CD19+ IgM+ IgD-細胞亞群比例顯著低于青年

10、組(P＜0.01)。老年組脾臟B細胞中CD24、Ki-67的mRNA表達水平顯著低于青年組(P＜0.01)，CD5、Bcl-2、caspase8和p16INK4α的mRNA表達水平顯著高于青年組(P＜0.05或P＜0.01)，Bax、caspase3、cyclinD1和cyclin E1的mRNA表達水平與青年組無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.不同年齡組BALB/c小鼠脾臟B細胞中β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子DVL2、DVL3

11、、CK1，下游靶基因PPARδ、CD44、Axin2的mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.經(jīng)過4次C57BL/6J小鼠來源的同種異基因BMSCs移植后，老年組小鼠脾臟B細胞比例和CD19的mRNA表達水平顯著升高(P＜0.01);B細胞中CD19+CD5+、CD19+ CD24+和CD19+ IgD+亞群比例顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）;Ki-67和p16INK4α的mRNA表達水平上調(diào)(P＜0.01)，CD5、CD

12、24和Caspase8的mRNA表達水平下調(diào)(P＜0.05)，其余基因表達無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.小鼠脾臟基質(zhì)老化表現(xiàn)為多種細胞外基質(zhì)成分的mRNA表達水平下調(diào)。
　　2.β-catenin信號分子對脾臟基質(zhì)老化有重要作用。
　　3.隨著年齡增加，小鼠脾臟B淋巴細胞比例維持穩(wěn)定，但增殖活性降低，部分亞群比例發(fā)生改變，可能與基質(zhì)老化有關(guān)。
　　4.同種異基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植可以影響部分老化相關(guān)的