衰老性骨質(zhì)疏松中自噬與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增齡性變化的關(guān)系的研究.pdf

1、衰老性骨質(zhì)疏松(Senile Osteoporosis)是年齡增長(zhǎng)引起的以骨吸收大于骨生成為特征的進(jìn)行性代謝性疾病,表現(xiàn)為骨量和骨強(qiáng)度的顯著降低,具體表現(xiàn)為:皮質(zhì)骨變薄、骨小梁數(shù)目減少、骨密度降低、骨間空隙增大、骨脆性增加,發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性增加。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells,BMMSCs)是位于骨髓腔內(nèi)的具有自我更新能力和多向分化能力的一類(lèi)中胚層來(lái)源的成體干細(xì)胞,在成骨、破骨平衡

2、中發(fā)揮重要作用,其隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)數(shù)量變化及生物學(xué)功能退化,是導(dǎo)致骨骼衰老性變化的重要因素。自噬(Autophagy)是細(xì)胞內(nèi)通過(guò)自噬體(Autophagosome)包繞胞漿內(nèi)底物如折疊錯(cuò)誤蛋白質(zhì)及損傷線粒體等并將其運(yùn)送至溶酶體(Lysosome)降解后循環(huán)再利用的機(jī)制,其水平與衰老及衰老性疾病密切相關(guān),但是,自噬在BMMSCs中增齡性變化中起何種作用及作用機(jī)制并不清楚,因此本文研究了衰老性骨質(zhì)疏松中BMMSCs的增齡性變化、自噬變化

3、以及自噬在其增齡性變化中的作用及機(jī)制,為衰老性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制及可能的治療手段的研究提供了新的方向。
　　【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚?br>　　1.探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增齡性變化;
　　2.探討自噬在自然衰老小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的變化;
　　3.探討自噬在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增齡性變化中的作用及作用機(jī)制。
　　【實(shí)驗(yàn)方法】：
　　1.Micro-CT掃描并重建年輕、年老小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁形態(tài);采用全骨髓培養(yǎng)法

4、分離培養(yǎng)并純化年輕、年老小鼠BMMSCs后,流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry,FCM)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志分子;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較兩種BMMSCs的自我更新能力;成骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種細(xì)胞的多向分化能力;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)并比較兩種細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡的生物學(xué)特性。
　　2.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)并比較年輕、年老小鼠BMMSCs衰老相關(guān)蛋白乙?；疨53、P21、P16的表達(dá)以及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

5、TERT蛋白的表達(dá);活性氧簇（reactive oxygen species,ROS)試劑盒檢測(cè)并比較兩種細(xì)胞的ROS水平。
　　3.實(shí)時(shí)定量酶連聚合反應(yīng)法(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)并比較年輕、年老小鼠BMMSCs自噬相關(guān)基因的表達(dá);Western Blot檢測(cè)并比較兩種細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白分子的表達(dá);免疫熒光染色檢測(cè)并比較兩種細(xì)胞中LC3分子的表達(dá);透射電子顯微鏡(

6、Transmission Electron Microscopy,TEM)觀察兩種細(xì)胞的自噬體形態(tài)及數(shù)量。
　　4.Western Blot檢測(cè)不同濃度自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)和自噬抑制劑3甲基腺嘌呤(3-methyl-adenine,3-MA)對(duì) BMMSCs自噬水平的影響,篩選有效濃度;RT-PCR檢測(cè)自噬激活劑和自噬抑制劑對(duì)年輕、年老小鼠BMMSCs的細(xì)胞周期相關(guān)基因及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響;ROS試劑盒

7、檢測(cè)自噬激活劑和自噬抑制劑對(duì)兩種細(xì)胞 ROS水平的影響。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】：
　　1.Micro-CT結(jié)果顯示:年老小鼠出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松;FCM鑒定年輕、年老小鼠BMMSCs表面標(biāo)記物結(jié)果顯示:兩種細(xì)胞表面標(biāo)記物的陽(yáng)性和陰性表達(dá)均符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性;克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:兩種細(xì)胞均能形成克隆集落,年老組較年輕組的克隆集落小且少,說(shuō)明年老組細(xì)胞自我更新能力低于年輕組;成骨、成脂誘導(dǎo)兩種細(xì)胞分化后,茜素紅,油紅O染色證明兩種細(xì)

8、胞均具有成骨、成脂分化的能力,年老組細(xì)胞成骨能力明顯低于年輕組,成脂能力明顯高于年輕組;FCM檢測(cè)顯示:年老組細(xì)胞增殖能力明顯低于年輕組(P<0.05)、細(xì)胞周期(G2+S期)明顯低于年輕組(P<0.05)、凋亡水平明顯高于年輕組(P<0.05)。
　　2.Western Blot結(jié)果顯示:年老組BMMSCs乙?；疨53、P21、P16蛋白分子的表達(dá)明顯高于年輕組細(xì)胞;年老組BMMSCs TERT蛋白分子的表達(dá)明顯低于年輕組細(xì)胞,

9、提示年老組細(xì)胞端粒酶活性較年輕組低;ROS試劑盒激光共聚焦顯微鏡觀察顯示:年老組BMMSCs熒光強(qiáng)度明顯高于年輕組細(xì)胞,提示年老組細(xì)胞ROS水平明顯高于年輕組。
　　3.RT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá),結(jié)果提示:年老小鼠 BMMSCs Beclin1、LC3基因表達(dá)明顯低于年輕組細(xì)胞(P<0.05);Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果提示:年老小鼠BMMSCs Beclin1、LC3II/LC3I

10、蛋白表達(dá)明顯低于年輕組細(xì)胞;激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細(xì)胞LC3熒光強(qiáng)度,結(jié)果提示:年老小鼠BMMSCs熒光強(qiáng)度明顯低于年輕組細(xì)胞;透射電子顯微鏡觀察兩種細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu),結(jié)果提示:兩種細(xì)胞內(nèi)均可觀察到典型的自噬體結(jié)構(gòu),年老組細(xì)胞自噬體少于年輕組細(xì)胞。
　　4.Western Blot結(jié)果顯示:100nM雷帕霉素較其他濃度藥物刺激能明顯提高BMMSCs中Beclin1的表達(dá),為最佳濃度,5mM3-MA較其他濃度藥物刺激能明顯降低BMM

11、SCs中Beclin1的表達(dá),為最佳濃度;RT-PCR結(jié)果顯示:雷帕霉素和3-MA均抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1(CCND1)、CyclinD2(CCND2)的表達(dá);RT-PCR結(jié)果顯示:雷帕霉素對(duì)年輕細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Caspase3、Caspase8無(wú)明顯影響,對(duì)年老細(xì)胞促進(jìn)凋亡相關(guān)基因 Caspase3、Caspase8的表達(dá),而3-MA對(duì)年輕、年老細(xì)胞均抑制 Caspase3、Caspase8的表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察

12、自噬激活劑和自噬抑制劑對(duì)ROS變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:10-4M H2O2刺激年輕組細(xì)胞后其熒光強(qiáng)度高于年輕組對(duì)照組細(xì)胞,說(shuō)明H2O2能顯著提高細(xì)胞ROS水平;100nM雷帕霉素+10-4M H2O2組細(xì)胞熒光強(qiáng)度低于H2O2刺激組,說(shuō)明自噬激活能有效降低H2O2刺激引起的ROS水平;100nM雷帕霉素刺激年老組細(xì)胞后其熒光強(qiáng)度明顯低于年老組對(duì)照組細(xì)胞,說(shuō)明激活自噬能有效降低年老細(xì)胞ROS水平;5mM3-MA刺激年輕組細(xì)胞后,其熒光強(qiáng)度明顯高

13、于年輕組對(duì)照組細(xì)胞,說(shuō)明抑制自噬能明顯提高細(xì)胞的ROS水平。
　　【結(jié)論】：
　　1.衰老BMMSCs出現(xiàn)一系列增齡性變化,表現(xiàn)為增殖能力下降,凋亡水平升高,成骨能力下降,成脂能力升高,乙?；疨53、P21、P16蛋白表達(dá)升高,端粒酶活性降低,ROS水平升高。
　　2.衰老BMMSCs的自噬水平較年輕細(xì)胞明顯降低。
　　3.激活自噬能降低BMMSCs的ROS水平,抑制自噬能提高BMMSCs的ROS水平;調(diào)節(jié)自噬可