基于HPPRRSV N蛋白的快速免疫檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV),最早出現(xiàn)于歐洲,并于90年代初期在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn),從此,PRRSV就成為世界養(yǎng)豬業(yè)中的一大難題。PRRSV能引起豬的繁殖障礙以及其他疾病例如呼吸問(wèn)題、體重減少和成長(zhǎng)問(wèn)題。
　　本研究通過(guò)復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組菌株BL21(DEB)(pET-N),經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI雙酶切鑒定可用后

2、,在先前優(yōu)化好的條件下誘導(dǎo)重組菌株BL21(DE3)(pET-N)6小時(shí),大量且穩(wěn)定的表達(dá)HPPRRSV中的核衣殼(N)蛋白;隨后對(duì)核衣殼蛋白進(jìn)行鎳柱純化,以及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè),結(jié)果證明:該質(zhì)粒上確實(shí)擁有ORF7基因,并且該基因插入至正確位置,pET-N質(zhì)粒正確。純化后的重組核衣殼蛋白的純度大于90％;Westernblot結(jié)果顯示:17kD處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶,這表示重組的核衣殼蛋白具有良好的特異性和免疫原性。

3、　　通過(guò)對(duì)間接ELISA實(shí)驗(yàn)中的抗原包被濃度、包被時(shí)間、封閉時(shí)間、封閉試劑、血清作用稀釋倍數(shù)、二抗作用時(shí)間與稀釋倍數(shù)等條件的優(yōu)化,建立間接ELISA實(shí)驗(yàn)方法,并確定該方法的臨界值、特異性、敏感性、變異系數(shù)及保質(zhì)期。結(jié)果證明,建立的間接ELISA方法可以用于檢測(cè)豬血清中抗N蛋白的抗體,且無(wú)明顯交叉反應(yīng)。
　　利用N蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,當(dāng)小鼠血清效價(jià)達(dá)到50000以上之后,進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),使用間接ELISA方法篩選出9株針對(duì)N蛋白的

4、細(xì)胞株和2株針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的細(xì)胞株。采用辛酸硫酸銨方法純化抗體后鑒定抗體亞型均為IgG型;抗體可以與PRRSV商品化試劑盒中的PRRSV抗原結(jié)合并得到陽(yáng)性結(jié)果,與其他常見(jiàn)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。說(shuō)明所得9株抗體的特異性很好。
　　在得到質(zhì)量良好的膠體金溶液后,優(yōu)化了會(huì)標(biāo)抗體的最適pH和最適標(biāo)記量、兔抗PRRSV N蛋白抗體、兔抗鼠IgG的最佳包被量,并按篩選的用量在玻璃纖維素膜進(jìn)行噴金,作為金標(biāo)準(zhǔn),在硝酸纖維素膜上分別包被兔抗PRRSV