EPO酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法學(xué)的建立與臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的： 建立一種針對(duì)促紅細(xì)胞生成素（EPO）的酶聯(lián)免疫學(xué)檢測(cè)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法，建立相關(guān)的試劑盒。應(yīng)用直接包被與間接包被方法。并運(yùn)用此試劑盒對(duì)臨床上相關(guān)疾病進(jìn)行檢測(cè)，了解其臨床應(yīng)用價(jià)值，指導(dǎo)相關(guān)疾病的診治。 方法： 1.免疫層析法將購(gòu)買的重組人類紅細(xì)胞生成素（rhEPO）抗原純化，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定蛋白含量。 2.抗體的純化。用金黃色葡

2、萄球菌蛋白A（SPA）親和層析法純化EPO抗體。 3.用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記EPO抗體。 4.用酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）的雙抗體夾心法制備直接包被的試劑盒，并對(duì)板、試劑、各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化探討。 5.利用生物素－親和素系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，將酶標(biāo)板包被BBC，與生物素化的抗體反應(yīng)，組盒。 6.將以上的直接包被法進(jìn)行靈敏性、重復(fù)性、穩(wěn)定性等的方法學(xué)評(píng)價(jià)。 7.用試劑盒檢測(cè)相關(guān)的腫瘤、貧血標(biāo)本，并進(jìn)

3、行正常血清的對(duì)照試驗(yàn)。與醫(yī)院常用的放射性免疫檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。 結(jié)果： 1.將抗體連接在凝膠上，裝在柱子中，制成免疫層析柱，依次過以下液體：平衡液，洗脫去帶分離抗原蛋白中的雜質(zhì)蛋白；高鹽溶液，洗去可以與凝膠柱的非特異結(jié)合蛋白；洗脫液，根據(jù)PH值的變化或者離子強(qiáng)度的改變，將于凝膠上的抗體結(jié)合的抗原蛋白洗脫下來。收集洗脫峰的各個(gè)部分，分裝到許多小瓶中，每個(gè)小瓶1ml。測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白濃度=1.75OD280-0.

4、74OD260，用進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)試劑盒測(cè)定各個(gè)收集組分，確定確為EPO抗原純化產(chǎn)物。 2.酶標(biāo)抗體的制備采用過碘酸鈉法。把HRP溶于乙酸鈉，與NaIO4室溫避光攪拌30min，用乙二醇終止上述氧化反應(yīng)。再透析脫鹽，上述酶液與抗體反應(yīng)，結(jié)束后，透析離心，取上清，過Sephadex G200層析柱。得到的即為標(biāo)記后的純化酶。測(cè)定酶的量：1.2mg/ml，IgG為3.2mg/ml。 3.ELISA最適條件的選擇如下：對(duì)比美國(guó)COST

5、AR板與國(guó)產(chǎn)板，前者在吸附性能、靈敏性及本底方面均優(yōu)于后者，選擇包被COSTAR酶標(biāo)板；對(duì)酶標(biāo)板經(jīng)過異丙醇活化和紫外照射后明顯可以降低本底的干擾，并且使板條的吸附性能有所加強(qiáng)；反應(yīng)時(shí)間最適為30min；溫度37℃；直接包被的抗體濃度在以純化的抗體的基礎(chǔ)之上，1：600為最合適，抗原標(biāo)準(zhǔn)品包含正常范圍的一系列濃度為0mU/mL、5mU/mL、10mU/mL、20mU/mL、40mU/mL、80mI/mL、160mU/mL，抗原制備的160

6、點(diǎn)相當(dāng)于制備純化抗原的1：400稀釋，酶標(biāo)抗體的最適合濃度為：1：3000稀釋。本試劑盒的范圍為5～160 mU/mL，足以包含正常范圍6～25mU/mL；靈敏度為0.46mU/mL；高濃度樣品平均回收率為106.74％，低濃度樣品平均回收率為104.78％；準(zhǔn)確度為38.982mU/mL；穩(wěn)定性良好；精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)變異<10％，批間變異<15％。ELISA方法測(cè)定的標(biāo)本值與放射免疫檢測(cè)符合性良好。 結(jié)論： 本