MiR-198、miR-203、miR-210、miR-34a對(duì)皮膚損傷修復(fù)過(guò)程中相關(guān)細(xì)胞功能影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　皮膚損傷修復(fù)是通過(guò)表皮干細(xì)胞的分化及增殖實(shí)現(xiàn)的，典型的皮膚損傷修復(fù)開始于角質(zhì)形成細(xì)胞從損傷邊緣的遷移，隨后的上皮再生過(guò)程還涉及損傷邊緣毛囊細(xì)胞的增殖及遷移?？偟膩?lái)說(shuō)，損傷修復(fù)過(guò)程在某種程度上類似于發(fā)育，而且同腫瘤細(xì)胞具有相似的細(xì)胞生物學(xué)特性以及分子變化。在皮膚的眾多調(diào)控因子中，microRNA(miRNA)是非常重要的一種。MiR-198近來(lái)被發(fā)現(xiàn)作為一種腫瘤抑制因子在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用，其通過(guò)抑制細(xì)胞的有絲分裂和

2、相關(guān)的運(yùn)動(dòng)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，但是miR-198在非腫瘤細(xì)胞或組織中對(duì)細(xì)胞增殖的抑制仍然少有研究。MiR-203是一種上皮組織特異性表達(dá)的miRNA，不僅參與皮膚發(fā)育，還具有抑癌和促凋亡作用。MiR-210是一種存在于多種組織細(xì)胞中的重要的缺氧相關(guān)miRNA，其表達(dá)廣泛參與了細(xì)胞的增殖、線粒體呼吸、DNA損傷修復(fù)、血管生成等病理生理過(guò)程。MiR-34a是目前研究較多的腫瘤相關(guān)miRNA。
　　研究目的：
　　皮膚染毒的

3、防治一直是芥子氣（硫芥）研究的重點(diǎn)。角質(zhì)形成細(xì)胞，尤其是基底層的表皮細(xì)胞是硫芥作用的主要靶細(xì)胞。硫芥損傷皮膚的機(jī)制尚未完全研究清楚，還沒(méi)有見(jiàn)到miRNA參與硫芥損傷的研究。
　　研究方法：
　　1、研究硫芥染毒人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT后，miR-198的表達(dá)變化。通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)miR-198的表達(dá)研究其對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)手段尋找miR-198新的可能的結(jié)合靶點(diǎn)，用熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)

4、行驗(yàn)證，并研究該靶點(diǎn)是否參與細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期調(diào)控。研究miR-198及其新靶點(diǎn)對(duì)HaCaT細(xì)胞的遷移和粘附能力的影響，利用生物信息學(xué)手段并結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究對(duì)mmu-miR-198進(jìn)行預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　2、研究硫芥染毒HaCaT細(xì)胞以及SKH-1無(wú)毛小鼠后，miR-203在細(xì)胞及染毒皮膚組織中的表達(dá)改變。在細(xì)胞水平上，研究miR-203對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，及其應(yīng)對(duì)硫芥損傷的能力。在動(dòng)物模型中，研究miR-203的表達(dá)改變對(duì)

5、小鼠皮膚切割傷、硫芥染毒損傷修復(fù)的影響，以及miR-203的表達(dá)改變是否對(duì)硫芥造成的骨髓和腸道損傷具有保護(hù)效應(yīng)。通過(guò)對(duì)臨床病例研究的收集整理，明確miR-203甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，分析miR-203作為腫瘤病人診斷和預(yù)后生存時(shí)間的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的可能性。
　　3、研究硫芥染毒HaCaT細(xì)胞以及SKH-1無(wú)毛小鼠后，miR-210在細(xì)胞及染毒皮膚組織中的表達(dá)改變。在細(xì)胞水平上，研究miR-210對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

6、在動(dòng)物模型中，研究miR-210的表達(dá)改變對(duì)小鼠皮膚切割傷、硫芥染毒損傷修復(fù)的影響，以及miR-210的表達(dá)改變是否對(duì)硫芥造成的骨髓和腸道損傷具有保護(hù)效應(yīng)。通過(guò)對(duì)臨床病例研究的收集整理，明確miR-210作為腫瘤病人預(yù)后生存時(shí)間的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的可能性。
　　4、通過(guò)對(duì)臨床病例研究的收集整理，明確miR-34a作為腫瘤病人預(yù)后生存時(shí)間的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的可能性。
　　研究結(jié)果：
　　1、硫芥染毒人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT后，

7、miR-198的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-198進(jìn)入HaCaT細(xì)胞抑制了細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期阻滯于G1期。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示細(xì)胞周期蛋白D2(cycling D2，CCND2)是miR-198的一個(gè)新的靶點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果提示，miR-198可以直接結(jié)合在CCND2的3'非編碼區(qū)（3'-Untranslated Regions，3'-UTR），下調(diào)細(xì)胞內(nèi)CCND2的mRNA和蛋白表達(dá)。而細(xì)胞內(nèi)CCND2水平的下調(diào)顯著抑制

8、了細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致了細(xì)胞周期的G1期阻滯。另外，miR-198促進(jìn)了HaCaT細(xì)胞的遷移和粘附能力，而CCND2的下調(diào)并未顯示相同的促遷移作用。利用生物信息學(xué)手段對(duì)mmu-miR-198的預(yù)測(cè)沒(méi)有取得預(yù)期的結(jié)果。
　　2、MiR-203在硫芥染毒的HaCaT細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化并不顯著，但在硫芥染毒小鼠皮膚組織中，miR-203在染毒后的不同時(shí)間以及不同部位均出現(xiàn)了顯著的表達(dá)變化。miR-203在細(xì)胞水平上具有的促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用

9、可能參與了小鼠皮膚組織中表皮細(xì)胞的損傷修復(fù)。在硫芥染毒小鼠的皮膚內(nèi)上調(diào)miR-203的表達(dá)雖然并沒(méi)有顯著的促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)，但相應(yīng)的下調(diào)miR-203的表達(dá)卻顯著的抑制了皮膚的損傷修復(fù)，而對(duì)于皮膚染毒的小鼠骨髓和小腸，miR-203的干預(yù)均出現(xiàn)了明顯的保護(hù)效應(yīng)。臨床病例研究提示miR-203甲基化參與了部分腫瘤內(nèi)miR-203表達(dá)的變化，而基于目前的研究現(xiàn)狀，miR-203作為腫瘤病人診斷和預(yù)后生存時(shí)間的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，并不令人滿意。

10、>　　3、MiR-210在硫芥染毒的HaCaT細(xì)胞中表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-210抑制了細(xì)胞的增殖和遷移，而抑制miR-210則出現(xiàn)相反的效應(yīng)。硫芥染毒小鼠的皮膚組織中，miR-210的表達(dá)在損傷后的不同時(shí)間均出現(xiàn)顯著上調(diào)。在硫芥染毒的小鼠皮膚中下調(diào)miR-210的表達(dá)不僅顯著的促進(jìn)了皮膚早期以及中期的損傷修復(fù)，也保護(hù)了染毒小鼠的骨髓和小腸。臨床的病例研究提示，miR-210在多種腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)變化，其高表達(dá)預(yù)示了腫瘤病人較

11、差的預(yù)后生存時(shí)間。
　　4、MiR-34a在多種腫瘤組織中均有顯著的表達(dá)變化。多數(shù)的研究證實(shí)了其高表達(dá)可以預(yù)測(cè)腫瘤病人較好的預(yù)后生存，而也有部分研究提出了相反的結(jié)論。通過(guò)meta分析，miR-34a在部分腫瘤中的高表達(dá)可以預(yù)測(cè)腫瘤病人較好的預(yù)后生存。
　　研究結(jié)論：
　　硫芥染毒人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT后，miR-198、miR-210的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，miR-203的表達(dá)變化不顯著。miR-198通過(guò)靶向CC

12、ND2抑制了HaCaT細(xì)胞的增殖，引起了細(xì)胞周期阻滯。MiR-203促進(jìn)了染毒HaCaT細(xì)胞的存活，對(duì)細(xì)胞遷移也有一定影響。MiR-210抑制了HaCaT細(xì)胞的增殖以及遷移。硫芥染毒小鼠皮膚中，miR-203和miR-210都發(fā)生了顯著變化，下調(diào)miR-203抑制了小鼠皮膚的損傷修復(fù)，而下調(diào)miR-210則促進(jìn)了小鼠皮膚的損傷修復(fù)。臨床病例分析提示，miR-210和miR-34a均是較為理想的腫瘤病人預(yù)后生存預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，而miR-