馬鈴薯與茄子原生質(zhì)體融合創(chuàng)制新資源研究.pdf

1、體細(xì)胞雜交技術(shù)不僅能夠克服有性生殖障礙，而且可以有效地同時(shí)轉(zhuǎn)移核基因與胞質(zhì)基因，促使優(yōu)良性狀在種內(nèi)、種間、屬間得到整合，從而獲得有性雜交無(wú)法得到的優(yōu)良種質(zhì)資源，豐富現(xiàn)有栽培種資源的遺傳背景。青枯病是茄科植物的重要的細(xì)菌性病害，其危害在馬鈴薯上僅次于晚疫病。目前我國(guó)馬鈴薯栽培品種缺少青枯病抗源，而存在于相關(guān)種中的優(yōu)良抗性資源由于有性雜交不親和又難以利用。因此，本研究旨在利用對(duì)稱(chēng)及非對(duì)稱(chēng)融合技術(shù)，將抗青枯病茄子優(yōu)良抗性基因染色體片段整合到馬

2、鈴薯栽培種中，創(chuàng)制抗青枯病馬鈴薯新資源。同時(shí)期望利用非對(duì)稱(chēng)融合技術(shù)轉(zhuǎn)移馬鈴薯染色體片段到茄子中，建立馬鈴薯染色體片段導(dǎo)入系，為馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)研究搭建新平臺(tái)。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.親本原生質(zhì)體培養(yǎng)體系建立研究在對(duì)親本倍性確認(rèn)的基礎(chǔ)上，采用本實(shí)驗(yàn)室建立的馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，選用7個(gè)馬鈴薯基因型進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，不同基因型間培養(yǎng)反應(yīng)差異較大。前期液體淺層培養(yǎng)反應(yīng)較好的只有3個(gè)基因型，包括8＃、AC142、A

3、C239。后續(xù)培養(yǎng)中，分化培養(yǎng)只有AC142能再生植株。此外，馬鈴薯二倍體野生種S.chacoence(C9701)雖然前期培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，但在繼續(xù)培養(yǎng)中可以分化植株。
　　茄子E508來(lái)源于抗青枯病基因型“本地紅茄”的種子，組織培養(yǎng)下無(wú)性繁殖用于原生質(zhì)體培養(yǎng)體系建立。使用不同的預(yù)處理方法，培養(yǎng)基和激素組合，研究顯示，培養(yǎng)4周的試管苗，采用CM培養(yǎng)液黑暗預(yù)處理24h，適宜于茄子原生質(zhì)體分離;CM-Ⅰ為適于茄子原生質(zhì)體前期培養(yǎng)的培養(yǎng)基

4、;后續(xù)培養(yǎng)的適宜激素組合為1.0mg/L NAA+0.1mg/L 2,4-D+0.25mg/L ZT+0.25mg/L BA。
　　2.馬鈴薯-茄子對(duì)稱(chēng)融合及其體細(xì)胞雜種鑒定研究以二倍體馬鈴薯AC142和茄子E508為融合親本，進(jìn)行原生質(zhì)體對(duì)稱(chēng)融合，共獲得了117個(gè)再生植株。使用15對(duì)馬鈴薯SSR標(biāo)記引物和6對(duì)茄子SSR標(biāo)記引物，鑒定確認(rèn)了34個(gè)株系為體細(xì)胞雜種。流式細(xì)胞儀分析了17個(gè)體細(xì)胞雜種的倍性水平，結(jié)果顯示，17個(gè)被測(cè)雜種

5、株系中，3個(gè)系峰值與四倍體馬鈴薯種相似;8個(gè)系含有兩個(gè)二倍體馬鈴薯基因組和1個(gè)二倍體茄子基因組（六倍體）;另有6個(gè)非整倍體。對(duì)一個(gè)與馬鈴薯四倍體峰值相似的系PE29-1和一個(gè)按峰值推測(cè)含有四倍體馬鈴薯基因組和二倍體茄子基因組的雜種PE3-4，進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果證明PE3-4染色體數(shù)為72，PE29-1染色體數(shù)為48，與流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果相符。
　　3.對(duì)稱(chēng)融合體細(xì)胞雜種染色體組成分別選取7個(gè)體細(xì)胞雜種（4個(gè)六倍體，1個(gè)四倍體和2

6、個(gè)非整倍體），采用基因組原位雜交(GISH)分析了其染色體組成。結(jié)果顯示，4個(gè)六倍體雜種均含有48條馬鈴薯染色體和24條茄子染色體。非整倍體的體細(xì)胞雜種PE60-10含54條馬鈴薯染色體，16條茄子染色體和7條重排染色體。對(duì)標(biāo)記檢測(cè)為雜種、倍性分析為四倍體的PE29-1進(jìn)行GISH分析，結(jié)果未檢測(cè)到茄子的雜交信號(hào)。上述結(jié)果表明，在馬鈴薯-茄子的融合中，即使是對(duì)稱(chēng)融合，也很難獲得具有二倍體馬鈴薯和二倍體茄子染色體的雜種，二倍體馬鈴薯在體細(xì)

7、胞雜種中更容易加倍為為四倍體，這種加倍是兩個(gè)馬鈴薯細(xì)胞和一個(gè)茄子細(xì)胞融合產(chǎn)生、還是在培養(yǎng)過(guò)程中馬鈴薯染色體的加倍目前還不清楚。在非整倍體雜種中更容易發(fā)生染色體重排。
　　4.對(duì)稱(chēng)雜種的胞質(zhì)組成研究采用在雙親間具有多態(tài)性的線(xiàn)粒體引物P4(pumD)分析了34個(gè)體細(xì)胞雜種的線(xiàn)粒體組成。結(jié)果顯示，除了PE29-4和PE57-4兩個(gè)株系只含有馬鈴薯親本帶以外，其它32個(gè)雜種株系線(xiàn)粒體均為雙親帶型，且在所有含有雙親帶型的雜種均出現(xiàn)了新帶型，

8、表明雙親線(xiàn)粒體基因組在融合后進(jìn)行了整合。選用兩個(gè)親本間具有多態(tài)性的葉綠體引物NTCP9和NTCP12，對(duì)體細(xì)胞雜種葉綠體基因組組成進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示34個(gè)體細(xì)胞雜種葉綠體擴(kuò)增帶型均與馬鈴薯親本一致。上述結(jié)果說(shuō)明，在體細(xì)胞雜種中，線(xiàn)粒體更容易發(fā)生重組，而葉綠體則只能保留一個(gè)親本的基因組，且可能偏向遠(yuǎn)緣融合中提供核背景較多的親本一方。
　　5.對(duì)稱(chēng)雜種的青枯病抗性評(píng)價(jià)本研究對(duì)11個(gè)生根正常的體細(xì)胞雜種初步進(jìn)行了青枯病抗性評(píng)價(jià)。使用青

9、枯菌1號(hào)生理小種對(duì)雜種株系試管苗進(jìn)行傷根接種，9個(gè)株系表現(xiàn)為抗青枯病，其中PE4-1的抗性顯著高于抗病茄子親本，其余8個(gè)系與之相當(dāng)。選擇試管苗接種后呈現(xiàn)抗性且缽栽生長(zhǎng)正常的3個(gè)株系進(jìn)行室外接種，3個(gè)株系抗性水平與茄子親本相當(dāng)，表明馬鈴薯-茄子原生質(zhì)體融合成功地將茄子的青枯病抗性轉(zhuǎn)移到馬鈴薯中。
　　6.馬鈴薯-茄子非對(duì)稱(chēng)融合及其融合子鑒定研究采用紫外線(xiàn)照射原生質(zhì)體破壞供體親本的染色體結(jié)構(gòu)，以利于融合中的染色體片段插入。
　　

10、以茄子E508為供體、馬鈴薯四倍體栽培種8＃為受體的非對(duì)稱(chēng)融合中，共獲得73個(gè)再生株系。使用流式細(xì)胞儀對(duì)47個(gè)株系進(jìn)行倍性分析，結(jié)果表明，36個(gè)株系為四倍體，6個(gè)為混倍體，2個(gè)為非整倍體，1個(gè)為八倍體，還有2個(gè)株系在測(cè)定過(guò)程分別出現(xiàn)主峰數(shù)量減少和峰值改變的現(xiàn)象，說(shuō)明在繼代過(guò)程中植株的染色體可能發(fā)生丟失。對(duì)16個(gè)非對(duì)稱(chēng)融合再生株系形態(tài)特征進(jìn)行了觀察評(píng)價(jià)，它們均能結(jié)薯，但在薯形、葉片形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)等性狀上具有不同程度的變異。這些變異是否因?yàn)榍炎?/p>

11、的染色體片段插入而引起，還有待進(jìn)一步研究。
　　對(duì)馬鈴薯栽培種DH訥16為供體、茄子E508為受體的非對(duì)稱(chēng)融合中，共獲得335個(gè)愈傷組織，到論文撰寫(xiě)時(shí)獲得12個(gè)再生植株。由于大部分再生株系生根困難，生長(zhǎng)緩慢，本研究只能對(duì)再生較早、能夠生根的3個(gè)株系進(jìn)行了鑒定分析。選用STI024、STI046和STM10883對(duì)在親本間具有有多態(tài)性的引物進(jìn)行分析，3個(gè)再生株系均含有馬鈴薯和茄子特異帶，表明它們?yōu)轶w細(xì)胞雜種。胞質(zhì)分析表明，雜種株系的