姜黃素與sti571聯(lián)合及序貫給藥對k562細胞增殖的影響

1、<p>　　姜黃素與STI571聯(lián)合及序貫給藥對K562細胞增殖的影響</p><p>　　【摘要】 目的研究姜黃素(Cur)與STI571聯(lián)合應(yīng)用對慢性粒細胞白血病(CML)細胞株K562增殖的影響,探索兩藥序貫給藥的不同效果。方法錐蟲藍排染計數(shù)計算K562細胞增殖抑制率;顯微鏡下觀察Cur與STI571聯(lián)合應(yīng)用對K562細胞的細胞毒作用;錐蟲藍排染法檢測藥物序貫給藥的不同效果;金氏公式評價兩藥的協(xié)

2、同效果。結(jié)果Cur與STI571單獨作用均抑制K562細胞的增殖,二者聯(lián)合應(yīng)用呈協(xié)同作用(Q&gt;1.15);顯微鏡下可見0.4 μmol/L STI571與 5 μmol/L Cur聯(lián)合應(yīng)用對K562細胞毒作用強于單獨應(yīng)用;先給予STI571作用24 h,再給予Cur作用24 h,對K562細胞的抑制呈協(xié)同作用(Q&gt;1.15),而先給予Cur作用24 h,再給予STI571作用24 h,則呈單獨相加或拮抗作用(

3、Q&lt;1.15)。結(jié)論Cur與不同濃度的STI571(0.1~0.4 μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制K562細胞增殖;聯(lián)合應(yīng)用STI571和Cur時,先給予STI571再給予Cur比先給予Cur再給予STI571協(xié)同效果好。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 中草藥 姜黃素 K562細胞 白血病 髓樣 慢性 藥物療法,聯(lián)合</p><p>　　慢性粒細胞白血病(chroni

4、c myelogenous leukemia,CML)是以費城染色體(Ph)為特征的多潛能干細胞異常的骨髓惡性增殖性疾病。在我國,CML約占各類白血病的15%~20%,僅次于急性粒細胞白血病(AML)和淋巴細胞性白血病(ALL),占慢性白血病的95%[1]。目前針對該病的發(fā)病特點所研制的STI571(Gleeve,CGP57148B,imatinib mesylate),具有獨特的作用機制和高效的特異性,在臨床上被廣泛應(yīng)用。但是,隨著該

5、藥的廣泛應(yīng)用,其不良反應(yīng)及耐藥問題相繼出現(xiàn)。因此,協(xié)同用藥成為目前研究STI571的一大熱點。姜黃素(curcumin,Cur)具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集等廣泛的藥理作用及毒性小等特點[23],與較小劑量STI571(0.1~0.15 μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用對抑制K562細胞增殖呈單獨相加,而與較大劑量STI571(0.2~0.8 μmol/L)可明顯協(xié)同下調(diào)P210bcr/abl和PKC的表達水平[4]。筆者進一步探討不同劑量的

6、STI571與Cur聯(lián)合應(yīng)用對K562細胞增殖的影響及序貫給藥產(chǎn)生的不同效果。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1材料</b></p><p>　　1.1.1藥品與試劑姜黃素(上海試劑三廠,批號980825),純度99%,溶解于二甲基亞砜(DMSO),配成20 mmol/L

7、儲存液于-20 ℃儲存?zhèn)溆?。STI571(瑞士諾華公司)經(jīng)本研究所萃取、重結(jié)晶所得,純度99%,溶解于DMSO,配成10 mmol/L,于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.1.2細胞株及培養(yǎng)條件人CML細胞株K562(中國科學院上海細胞研究所),培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×108 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2中培養(yǎng)。細

8、胞接種24 h后進入指數(shù)增長期。</p><p><b>　　1.2方法</b></p><p>　　1.2.1Cur和/或STI571對K562細胞的影響取指數(shù)增長期的K562細胞100 μL[(2~4)×109L-1]加入96孔板中,每個加藥組設(shè)3個復孔,分別設(shè)空白組,Cur 2.5,5,10,20 μmol/L,STI571 0.1,0.2,0.4,0

9、.8,1.6,3.2 μmol/L的單獨作用濃度以及STI571 0.1,0.2,0.4 μmol/L與Cur 5 μmol/L聯(lián)合作用濃度,給藥后各孔終體積相同。將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后用錐蟲藍排染計數(shù)，計算抑制率。</p><p>　　抑制率=[(空白組-實驗組)/空白組]×100%</p><p>　　1.2.2Cur和/或S

10、TI571對K562細胞的細胞毒作用取指數(shù)增長期的K562細胞100 μL[(2~4)×109L-1]加入96孔板中,每個加藥組設(shè)3個復孔,分別設(shè)空白組,Cur 5 μmol/L,STI571 0.4 μmol/L單獨作用濃度以及二者聯(lián)合作用濃度,給藥后各孔終體積相同。將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后顯微鏡下觀察細胞的存活情況。</p><p>　　1.2.3序貫

11、給藥取指數(shù)增長期的K562細胞100 μL[(2~4)×109L-1]加入96孔板中,每個加藥濃度設(shè)3個復孔,分別設(shè)空白、Cur 5,10 μmol/L、STI571 0.05,0.1,0.2,0.4 μmol/L的給藥濃度，給藥后各孔終體積相同。藥物聯(lián)合作用觀察:細胞先給予STI571 0.05,0.1,0.2 μmol/L作用24 h,然后給予不同濃度Cur作用24 h;以及細胞先給予不同濃度Cur作用24 h,再給予ST

12、I571 0.1,0.2,0.4 μmol/L作用24 h。將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待藥物作用時間結(jié)束用錐蟲藍排染計數(shù)。</p><p>　　1.3統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)用x±s表示,組間差異用t檢驗。計算兩藥聯(lián)合應(yīng)用時,用金氏公式求協(xié)同指數(shù)（Q值）[5]。</p><p><b>　　2結(jié)果</b></p>&l

13、t;p>　　2.1Cur和/或STI571對K562細胞的影響藥物作用后,錐蟲藍排染計數(shù),Cur 2.5,5,10,20 μmol/L作用于K562細胞24 h后,細胞生長抑制率分別為3%,12%,61%和84%,呈量效關(guān)系(圖1A)。不同濃度的STI571(0.1~3.2 μmol/L)作用24 h,K562細胞生長抑制率分別為12%,24%,54%,70%,90%和100%,呈量效關(guān)系(圖1B)。不同濃度的STI571(0.1

14、,0.2,0.4 μmol/L)和/或Cur 5 μmol/L對K562作用24 h。其中單獨STI571 0.1,0.2,0.4 μmol/L對K562細胞的生長抑制率分別為12%,23%和54%;單獨Cur 5 μmol/L對K562細胞的生長抑制率為12%;但二者聯(lián)合應(yīng)用后,細胞生長抑制率則分別提高到36%,54%和85%(圖1C),Q值分別為1.62,1.64和1.48。Cur 5 μmol/L和不同濃度的STI571進行聯(lián)合作

15、用的Q值均&gt;1.15(圖1D)。</p><p>　　2.2STI571和/或Cur對K562細胞的細胞毒作用單獨給予STI571 0.4 μmol/L與Cur 5 μmol/L 24 h后,鏡下可見少量活的K562細胞,細胞膜完整,光亮透明,部分細胞質(zhì)飽滿腫脹,可見細胞碎片以及形態(tài)不一的細胞。兩藥聯(lián)合作用后,鏡下罕見活細胞,可見較多的細胞壞死殘片、顆粒等(圖2)。</p><

16、p>　　2.3藥物序貫給藥的效果K562細胞先給予STI571 0.05,0.1,0.2 μmol/L作用24 h,再給予Cur 5,10 μmol/L作用24 h，兩藥聯(lián)合作用的Q值均&gt;1.15(表1);而先給予Cur 5,10 μmol/L作用24 h,再給予STI571 0.1,0.2，0.4 μmol/L作用24 h,Q值均&lt;1.15(表2)。福建醫(yī)科大學學報2007年5月第41卷第3期張昆仲等

17、：姜黃素與STI571聯(lián)合及序貫給藥對K562細胞增殖的影響A:Cur對K562細胞的量效關(guān)系曲線; B:STI571對K562細胞的量效關(guān)系曲線; C:不同濃度STI571與Cur 5 μmol/L對K562細胞的作用; D:不同濃度STI571與Cur 5 μmol/L對K562細胞作用的協(xié)同指數(shù).Cur:姜黃素.與空白組比較,☆:P&lt;0.05; 與單獨給予STI571比較,#:P&lt;0.05.</p

18、><p><b>　　3討論</b></p><p>　　目前,STI571是臨床上治療費城染色體陽性(Ph+)的慢性粒細胞白血病慢性期的首選藥物,但是在臨床廣泛使用后出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象。耐藥性的產(chǎn)生主要是由于p210bcr/abl癌蛋白與STI571結(jié)合的部位發(fā)生點突變所致,其他尚有少量P210bcr/abl過量表達或不依賴P210bcr/abl等耐藥病例[6]。STI57

19、1的耐藥問題是該藥在臨床應(yīng)用面臨的一大難題,而探索解決其耐藥問題是科學家研究的熱點,目前普遍表1STI571和Cur序貫給藥對K562細胞的協(xié)同效果</p><p>　　Tab 1The sequential administration of STI571 alone or combined with Cur on K562 cellscSTI571μmol·L-1cCurμmol·L-1生

20、長抑制率%Q值協(xié)同表2Cur和STI571序貫給藥對K562細胞的協(xié)同效果</p><p>　　Tab 2The sequential administration of Cur alone or combined with STI571 on K562 cellscCurμmol·L-1cSTI571μmol·L-1生長抑制率%Q值協(xié)同</p><p>　　等級006

21、0.67±5.6600.149.33±2.3900.224.50±0.8200.414.67±4.735040.17±5.941004.33±0.4750.141.50±2.040.68-50.223.50±0.700.84-50.47.17±1.541.05+100.15.00±2.160.97+100.23.17±0.850

22、.98+100.41.00±0.821.00+Cur:姜黃素.</p><p>　　認為,聯(lián)合用藥是減緩STI571耐藥的主要策略。STI571和熱休克蛋白90抑制劑格爾德霉素(GA)及低毒性的類似物17烯丙氨格爾德霉素(17AAG)、STI571和三氧化二砷、STI571和組蛋白去乙?；敢种苿?HID)等均可有效誘導耐STI571的慢粒白血病細胞凋亡,但采取何種聯(lián)合用藥策略需根據(jù)對STI571產(chǎn)

23、生耐藥的機制而定[79]。本研究是利用傳統(tǒng)中藥姜黃中主要成分Cur進行研究。Cur對K562細胞的作用可能存在多靶點,即除了可下調(diào)P210bcr/abl外,還可作用于熱休克蛋白家族90伴侶蛋白[10]。</p><p>　　本實驗結(jié)果表明,Cur可協(xié)同STI571抑制K562細胞的生長,這可能與其協(xié)同下調(diào)P210bcr/abl從而下調(diào)其下游的信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)[4]。</p><p>　　

24、采取聯(lián)合給藥的方式也影響給藥效果,本研究表明,對于K562細胞先給予STI571作用24 h再給予Cur作用24 h,效果優(yōu)于先給予Cur作用24 h再給予STI571作用24 h。STI571是酪氨酸激酶抑制劑,本身對p210bcr/abl蛋白含量影響較小[11],其作用是由于占據(jù)了ABL激酶區(qū)域的ATP口袋,阻遏ATP與ABL結(jié)合,從而抑制其激酶活性,阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導[1213]。先給予STI571以后,藥物抑制了酪氨酸激酶活性

25、,此時再給予Cur,后者可能通過下調(diào)P210bcr/abl含量,影響P210bcr/abl激活的下游信號通路(如PKC等)而產(chǎn)生誘導CML細胞株凋亡,抑制細胞增殖,從而與STI571發(fā)揮協(xié)同抑制作用,即藥物通過雙層阻斷而達到協(xié)同抑制K562細胞的作用。反之,先給予Cur作用24 h再給予STI571,藥物的聯(lián)合作用僅出現(xiàn)單獨相加甚至拮抗,其機制可能是Cur不僅可以減少P210bcr/abl含量,還可以抑制酪氨酸激酶活性，Cur單獨作用2

26、4 h后,可能與STI571競爭占據(jù)ABL激酶區(qū)域的ATP口袋,阻遏了ATP與ABL結(jié)合,因此出現(xiàn)單獨相加或拮抗作用。有</p><p>　　Cur的研究近年來不斷受到重視,尤其在抗癌方面。Cur和STI571聯(lián)合應(yīng)用,對K562細胞呈劑量依賴性的抑制作用,二者呈協(xié)同作用,先給予STI 571作用24 h,再聯(lián)合應(yīng)用Cur的協(xié)同效果更好。本實驗為進一步研究Cur與STI571的聯(lián)合應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。</p

27、><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　\[1\]O’Dwyer M E, Druker B J. Chronic myelogenous leukemia: new therapeutic principles\[J\]. J Intern Med, 2001,250(1):39.</p><p>　　\[2\]Ammo

28、n H P, Wahl M A. Pharmacology of curcuma longa\[J\]. Planta Med, 1991,57(1):17.</p><p>　　\[3\]Aggarwal B B, Kumar A, Bharti A C. Anticancer potential of curcuma: preclinical and clinical studies\[J\]. Antic

29、ancer Res, 2003,23(1A):363398.</p><p>　　\[4\]張昆仲,許建華,黃秀旺,等. 姜黃素與STI571對慢性粒細胞白血病細胞株K562作用的體外研究\[J\]. 福建醫(yī)科大學學報, 2006,40(5):427430.</p><p>　　\[5\]金正均. 合并用藥中的相加\[J\]. 中國藥理學報, 1980,1(2):7076.</

30、p><p>　　\[6\]Corre M E,Mohammed M,Ellwood K,et al. Clinical resistance to STI571 cancer therapy caused by BCR/ABL gene mutation or amplification\[J\]. Science, 2001, 293(5531):876880.</p><p>　　\[

31、7\]Blagosklonny M V,Fojo T,Bhalla K N,et al. The HSP90 inhibitor geldanamycin selectively sensitizes BcrAblexpressing leukemia cells to cytotoxic chemotherapy\[J\]. Leukemia, 2001, 15(10):15371543.</p><p>

32、;　　\[8\]Perkins C,Kim C N,Fang G,et al. Arsenic induces apoptosis of multidrugresistant human myeloid leukemia cells that express Bcr/Abl or overexpress MDR,MRP,Bcr2,or BclXI\[J\]. Blood, 2000, 95(3):10141022.</p&

33、gt;<p>　　\[9\]Nimmanapalli R,Fuino L,Bali P,et al. Histone deacetylase inhibitor LAQ824 both lowers expression and promotes proteasomal degradation of BcrAbl and induces apoptosis of imatinib mesylatesensitive o

34、r refractory chronic myelogenous leukemiablast crisis cells\[J\]. Cancer Res, 2003,63(16):51265135.</p><p>　　\[10\]Zhang K Z,Xu J H,Huang X W,et al. Curcumin synergistically augments bcr/abl phosphorothio

35、ate antisense oligonucleotides to inhibit growth of chronic myelogenous leukemia cells\[J\]. Acta Pharmacologica Sinica, 2007, 28(1):105110.</p><p>　　\[11\]Weisberg E,Griffin J D. Mechanism of resistance to

36、 the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABLtransformed hematopoietic cell lines\[J\]. Blood, 2000,95(11):34983505.</p><p>　　\[12\]O'Dwyer M E,Mauro M J,Druker B J. Recent advancements in the t

37、reatment of chronic myelogenous leukemia\[J\]. Annul Rev Med, 2002,3:369381.</p><p>　　\[13\]Deininger M W,Goldman J M,Melo J V. The molecular biology of chronic myeloid leukemia\[J\]. Blood, 2000,96(10):334