內質網(wǎng)應激誘導肝癌細胞化療抵抗的機制及丹皮酚的逆轉作用.pdf

1、背景與目的:原發(fā)性肝癌是常見的消化道惡性腫瘤,其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第三位。在我國肝癌發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢,己嚴重威脅著人們的生命與健康。目前手術仍是治療肝癌的首選方案,但多數(shù)患者就診時已屬中晚期,喪失了手術機會,此時化療成為肝癌治療的重要手段,但療效很不理想。研究發(fā)現(xiàn),內質網(wǎng)應激與腫瘤的關系甚為密切,是肝癌抗拒化療藥物的重要原因,因此研究內質網(wǎng)應激介導的化療抵抗的原因和調控機制,進而通過特異性干預手段提高腫瘤細胞對化療藥物的

2、敏感性,對于提高治療效果,延長患者生存期十分必要[19-21]。
　　從天然產(chǎn)物中尋求高效、低毒的新型抗肝癌藥物并深入探討其抗腫瘤機制是當前國內外研究的重要課題。丹皮酚(Paeonol, Pae)又稱牡丹酚,是我省道地中藥材毛莨科植物牡丹 Paeonia Suffruicosa Andr根皮和蘿摩科植物徐長卿 Pycnostelma Paniculatum(Bunge) K. Schum干燥根或全草的主要有效成分,具有鎮(zhèn)靜催眠、解

3、熱鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)及保護心腦血管等廣泛的藥理活性。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),Pae對體內外的多種腫瘤細胞的增殖有較強的抑制作用,此外,我們也發(fā)現(xiàn)Pae能增強順鉑對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和人食管癌細胞Eca-109、SEG-1的增殖抑制作用。但丹皮酚是否可逆轉內質網(wǎng)應激介導的化療抵抗中目前尚未報道,本研究首先探討了內質網(wǎng)應激在介導肝癌細胞對化療藥物抵抗中的作用及機制,并觀察了丹皮酚在逆轉內質網(wǎng)應激介導的化療抵抗的作用,同時探討

4、其可能的作用機制,以期為肝癌的臨床治療提供新的方法。
　　目的:探討內質網(wǎng)應激在肝癌細胞化療抵抗中的機制及丹皮酚的逆轉作用
　　方法
　　(1)采用MTT法觀察TM誘導的內質網(wǎng)應激對阿霉素抑制HepG2肝癌細胞增殖的作用;采用流式細胞儀、TUNEL檢測法觀察TM誘導的內質網(wǎng)應激對阿霉素誘導HepG2肝癌細胞凋亡的影響。
　　(2)Western-blot法觀察 TM誘導的內質網(wǎng)應激對 HepG2肝癌細胞 COX-

5、2,GRP78表達的影響;MTT、流式細胞儀、TUNEL法觀察COX-2選擇性抑制劑塞來昔布在TM誘導的內質網(wǎng)應激狀態(tài)下對阿霉素抑制肝癌細胞增殖及誘導肝癌細胞凋亡的影響;用Western-blot法觀察COX-2選擇性抑制劑塞來昔布和PI3K抑制劑LY294002對內質網(wǎng)應激誘導的HepG2肝癌細胞COX-2, p-AKT,CHOP表達的影響;
　　(3)采用流式細胞儀、TUNEL法觀察丹皮酚在TM誘導的內質網(wǎng)應激狀態(tài)下對阿霉素誘

6、導HepG2肝癌細胞凋亡的影響;用Western-blot法觀察丹皮酚對內質網(wǎng)應激誘導的HepG2肝癌細胞COX-2,p-AKT,CHOP表達的影響。
　　結果
　　1.內質網(wǎng)應激在肝癌細胞對阿霉素敏感性中的作用
　　(1)采用MTT法,觀察衣霉素(Tunicamycin,TM)處理組、阿霉素處理組及TM預處理的阿霉素組對HepG2肝癌細胞的增殖抑制作用。與阿霉素處理組相比,TM預處理的阿霉素組的細胞增殖抑制率明顯下降

7、。
　　(2)采用FCM和TUNEL法,觀察對照組、TM處理組、阿霉素處理組及TM預處理的阿霉素組對HepG肝癌細胞的凋亡。與阿霉素處理組相比,TM預處理的阿霉素組的細胞凋亡率明顯下降。提示內質網(wǎng)應激可誘導肝癌細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗。
　　2.內質網(wǎng)應激誘導肝癌細胞對化療抵抗的機制
　　(1)用Western-blot法觀察TM作用于HepG2肝癌細胞0h,4h,8h后 GRP78, COX-2的表達情況。結果表明,使

8、用 TM作用 HepG2肝癌細胞4h即可誘導GRP78表達的增多,提示內質網(wǎng)應激的產(chǎn)生,并且 COX-2的表達隨時間的延長逐漸增加。
　　(2)采用MTT法,觀察阿霉素處理組、TM預處理的阿霉素組及塞來昔布(50umol/L)+TM預處理的阿霉素組對 HepG2肝癌細胞的增殖抑制作用。與阿霉素處理組相比,TM預處理的阿霉素組的細胞增殖抑制率明顯下降;與 TM預處理的阿霉素組相比,塞來昔布素+TM預處理的阿霉素組的細胞增殖抑制率明顯

9、升高。
　　(3)采用FCM和TUNEL法,觀察阿霉素處理組、TM預處理的阿霉素組及塞來昔布+TM預處理的阿霉素組對 HepG2肝癌細胞凋亡的影響。與阿霉素處理組相比,TM預處理的阿霉素組的細胞凋亡率明顯下降;與 TM預處理的阿霉素組相比,塞來昔布+TM預處理的阿霉素組的細胞凋亡率明顯提高。提示抑制COX-2可逆轉內質網(wǎng)應激誘導的肝癌細胞對化療藥物的抵抗。
　　(4)用Western-blot和QRT-PCR法從基因和蛋白水

10、平觀察COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對HepG2肝癌細胞內質網(wǎng)應激性凋亡蛋白CHOP的表達的影響,結果表明,使用 COX-2選擇性抑制劑塞來昔布可增加 CHOP的表達,提示對 CHOP的調控可能是內質網(wǎng)應激誘導COX-2產(chǎn)生化療抵抗的重要原因
　　(5)用 Western-blot法觀察 COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對 HepG2肝癌細胞PI3K/AKT表達的影響,結果表明,使用COX-2選擇性抑制劑塞來昔布可在抑制COX-2表

11、達的同時,抑制p-AKT的表達,同時用Western-blot法觀察PI3K抑制劑LY294002對內質網(wǎng)應激誘導的HepG2肝癌細胞COX-2的表達的影響,結果表明,使用PI3K抑制劑LY294002對內質網(wǎng)應激誘導的COX-2的表達無影響,提示COX-2可調控PI3K/AKT通路的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑 LY294002也可在抑制肝癌細胞 HepG2 p-AKT的同時,肝癌細胞的CHOP表達增多,提示抑制COX-2/

12、PI3K/AKT通路繼而調控CHOP的表達可逆轉內質網(wǎng)應激誘導的肝癌細胞對化療藥物的抵抗。
　　3.丹皮酚在內質網(wǎng)應激誘導肝癌細胞對化療藥物抵抗中的作用
　　(1)采用FCM和TUNEL法,觀察阿霉素處理組、TM預處理的阿霉素組及丹皮酚(31.25mg/L)+TM預處理的阿霉素組對HepG2肝癌細胞的凋亡的影響。與阿霉素處理組相比,TM預處理的阿霉素組的凋亡率明顯下降;與TM預處理的阿霉素組相比,丹皮酚(31.25mg/L)

13、+TM預處理的阿霉素組的凋亡率明顯提高。提示丹皮酚可逆轉內質網(wǎng)應激誘導的肝癌細胞對化療藥物的抵抗。
　　(2)用 Western-blot法觀察丹皮酚對內質網(wǎng)應激誘導的HepG2肝癌細胞 COX-2, p-AKT,CHOP的表達的影響。結果表明,使用丹皮酚可抑制內質網(wǎng)應激誘導的HepG2肝癌細胞的COX-2的表達,同時,在丹皮酚抑制內質網(wǎng)應激誘導的COX-2的同時,HepG2肝癌細胞 p-AKT的表達逐漸下降,并伴隨 HepG2肝

14、癌細胞的CHOP表達增多,與COX-2選擇性抑制劑塞來昔布和PI3K抑制劑LY294002作用內質網(wǎng)應激誘導的肝癌細胞 CHOP的表達結果相似。提示丹皮酚可能通過COX-2/PI3K/AKT通路上調 CHOP的表達逆轉內質網(wǎng)應激誘導的肝癌細胞對化療藥物的抵抗。
　　結論
　　1.內質網(wǎng)應激可能通過COX-2/PI3K/AKT通路調控CHOP的表達介導肝癌細胞對化療藥物的抵抗。
　　2.丹皮酚可能通過COX-2/PI3K