中期因子誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抗失巢凋亡的作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與、多階段發(fā)展的極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程。腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，侵入血管或淋巴管中，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）。然后CTCs通過血液循環(huán)系統(tǒng)在遠(yuǎn)隔器官中溢出、增殖，最后形成轉(zhuǎn)移灶。失巢凋亡是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或鄰近細(xì)胞失去接觸而導(dǎo)致的一種特殊的細(xì)胞死亡方式，在組織發(fā)育和機(jī)體平衡中起著重要作用，也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一道屏障。然而，部分CTCs形成某種機(jī)制

2、逃逸失巢凋亡，得以存活下來并播散到全身。中期因子（midkine，MK）是糖胺聚糖或肝素結(jié)合生長因子家族的成員之一，在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，并參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程。以前我們的研究表明，MK在肝癌組織和血清中表達(dá)增高，并且與肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和CTCs形成有關(guān)。我們推測(cè)MK可能參與失巢凋亡抵抗機(jī)制，介導(dǎo)肝癌CTCs在血液循環(huán)中存活的調(diào)節(jié)。本課題通過懸浮培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，建立失巢凋亡模型，并驗(yàn)證該模型的可行性，為后續(xù)MK誘導(dǎo)的抗失巢凋亡實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)

3、。然后通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究MK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的特性，初步探討可能涉及的分子機(jī)制。
　　研究方法
　　1.懸浮培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，建立失巢凋亡模型。
　　將肝癌細(xì)胞接種于鋪有Poly-HEMA膠的6孔板中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并與貼壁培養(yǎng)進(jìn)行比較研究。
　?。?）光鏡下觀察在不同培養(yǎng)條件下肝癌細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)學(xué)變化。
　?。?）TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V-FIT

4、C/PI雙染法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。
　　2.研究MK促進(jìn)懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞凋亡抵抗、增殖和侵襲的作用。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V-FITC/PI雙染法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　?。?）MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　?。?）Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲。
　　3．研究MK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的分子機(jī)制。
　?。?）免疫熒光染色法檢測(cè)懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞經(jīng)MK處理后NF-κB表達(dá)的

5、變化。
　　（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞經(jīng)MK、AKT抑制劑和NF-κB通路抑制劑單獨(dú)或聯(lián)合處理后細(xì)胞凋亡率的變化。
　?。?）Western Blot分析懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞經(jīng)MK處理后NF-κB、AKT信號(hào)通路關(guān)鍵分子及相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2和caspase-3的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.建立了肝癌細(xì)胞失巢凋亡模型。
　?。?）懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞體積縮小，形態(tài)變圓，并聚集成團(tuán)生長。

6、>　?。?）TUNEL染色結(jié)果顯示，懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞晚期失巢凋亡明顯高于貼壁培養(yǎng)的相同肝癌細(xì)胞，晚期失巢凋亡率分別為（28.76±3.49）%vs.（5.42±0.79）%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)條件下，Hep3B肝癌細(xì)胞總凋亡率均隨著時(shí)間延長（72 h內(nèi)）而增高，呈時(shí)間依賴性；在不同時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h和72 h），懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞失巢凋亡均明顯高于

7、貼壁培養(yǎng)的相同肝癌細(xì)胞，總凋亡率之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PI染色結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長（24 h、48 h和72 h），G1期細(xì)胞比率逐漸增加，分別為44.17%、57.99%和66.99%。細(xì)胞靜止在G1/S期。
　　2．MK能夠增強(qiáng)懸浮培養(yǎng)的Hep3B肝癌細(xì)胞失巢凋亡抵抗、增殖和侵襲能力。
　?。?）MK能夠誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)的Hep3B肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡。用不同濃度MK（10 ng/mL、50 ng/mL、

8、100 ng/mL和200 ng/mL）處理懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞24 h后，凋亡率明顯低于MK未處理組，且具有濃度依賴性，分別為（19.38±2.07）%、（15.63±1.63）%和（11.53±2.11）%vs.（24.31±2.49）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）MK能夠促進(jìn)懸浮培養(yǎng)的Hep3B肝癌細(xì)胞增殖。MK作用于懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞48 h后，隨著 MK濃度增加細(xì)胞增殖逐漸上升。各處理組均高于未處理組

9、（P<0.05）。
　?。?）MK能夠提高懸浮培養(yǎng)的Hep3B肝癌細(xì)胞侵襲能力。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，與未處理組相比，MK處理組肝癌細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，在10 ng/mL-100 ng/mL范圍內(nèi)呈濃度依賴性。未處理組肝癌細(xì)胞穿膜數(shù)為（15.02±1.82）個(gè)/視野，處理組（10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL）分別為（35.04±3.27）個(gè)/視野、（53.33±3.09）個(gè)/視

10、野、（78.32±5.44）個(gè)/視野和（74.96±4.32）個(gè)/視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3．MK通過活化NF-κB和AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡。
　　（1）經(jīng)MK處理后，懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞NF-κB表達(dá)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)。
　　（2）經(jīng)MK處理后，懸浮培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞NF-κB和pAKT表達(dá)增高，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，而促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)下調(diào)。
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